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1、细胞冻存和细胞复苏的方法步骤点击次数：3337发布时间：2011-4-12细胞的冻存一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存 细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引 起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述 原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细 胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白 复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多， 随冷冻温度的降
2、低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死 亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用 甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下 降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗 出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。二、细胞冻存操作步骤：(1) 选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去 掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液 反复吹打瓶壁上的细胞，使其成
3、为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然 后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min,10分钟)。去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4C预冷15分钟后，逐滴加入已无菌 的DMS0或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3X1061X107/mL之间。(3) 将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装11.5mL在火焰喷灯上封口，封口 处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好 登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。(4) 将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液 氮中。采用控制降温速
4、度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4C冰箱中23小时， 再移至冰箱冷冻室内34小时(此步可省略)，再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最 后沉入液氮中。细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏 培养，观察生长情况，然后再继续冻存。三、常用冷冻设备和材料常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点：(1) 一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196C，使用时注意勿让液 氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。(2) 液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。(3) 在装入液氮时，
5、要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底， 如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器 损坏。细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%20%的血清培养液，DMS0(分析纯)或无 色新鲜甘油(121C蒸气高压消毒)，2mL安瓿(或专用细胞冻存管)、吸管、离心管、喷灯、 纱布袋(或冻存管架)等。细胞的复苏一、细胞复苏的原则 在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证 细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。二、细胞复苏的主要操作步骤(1) 佩戴眼镜和手套，
6、从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。(2) 迅速放入38C水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。(3) 在1000r/min速度下离心510分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中， 接种浓度1 X109/L，置37C温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情 况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养 1224 小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。三、注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通 过最易受损的温度段(-50C)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而， 由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮 在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。
