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1、准备:5毫升移液器,1毫升移液器1、脯氨酸含量的测定原理：当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，不仅大大减少了其 他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性加热条件下，脯 氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，再用甲苯萃取，此缩合物在520nm波长有一最 大吸收峰。脯氨酸含量的高低在一定范围内与其消光度成正比。从标准曲线上查出（或用回 归方程计算）脯氨酸的含量。步骤：1、脯氨酸提取：称取干样0.05g（精确记录样品质量）放入13毫升带盖离心管中，加10ml 超纯水，将管口套上封口袋（用油性记号笔标记管内溶液高度），加盖后沸水浴提取60min，
2、冷却后静止大约三个小时，放置冰箱保鲜层静止过夜，用超纯水补充蒸发水分（根据记号笔做的记号），最后吸取上清液到另13毫升带盖离心、管中，保存上清液用于测定脯氨总氨基酸，游离阳离子（Na、K、Ca、Mg、Fe），NO3-, Cl-, H2PO4-, SO42-, 可溶糖。没测完一个指标后，提取液要放在水浴锅100度5分钟灭菌，然后冻在冰箱中。2、脯氨酸含量测定：取1ml提取液+1ml 3%磺基水杨酸+1ml冰醋酸+2ml 2.5%酸性茚三酮 加入玻璃试管中沸水浴显色反应60min，冷却至室温后向其加入4ml甲苯 振荡萃取红色物质，静止后用吸管或5毫升移液器吸取红色液体比色.。 注意：每次比色时，都
3、要用无水乙醇或甲苯将比色皿和吸管清洗，如果用 5毫升移液器吸取红色液体比色，则用准备很多枪头就可以了。药品配制：1、3%磺基水杨酸例如配置500ml，即将15g磺基水杨酸溶于500ml超纯水中。2、 2.5%酸性茚三酮显色液 冰乙酸和6mol/L的磷酸以3:2混合作为溶剂进行配置。即若 配置250ml 2.5%的酸性茚三酮的话，所需试剂为：6.25g茚三酮；150ml冰乙酸；100ml 6mol/L 磷酸（40.8ml浓磷酸加59.2ml超纯水中）注意事项：1、磺基水杨酸需现用现配（24小时内失效）2、酸性茚三酮：于70C加热溶液，冷却后置棕色试剂瓶中，4C下保存备用，2-3天内有效。 含量计
4、算：根据已有标准曲线计算含量：脯氨酸含量（Amol/g.DW） =（OD值-0.00208）*1000/（3.07*样品 质量*115）也可自行做标准曲线:脯氨酸标准曲线制作:脯氨酸标准液的配制：（1）在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量超纯水溶解，然后 倒入250 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100 ug。（2）系列脯氨酸浓度的配制。取5个50 ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液1.0 ml、2.0 ml、 3.0ml、4.0ml、5.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为2 ug/ml、 4 ug/ml、 6 ug/ml、
5、8 ug/ml、 10 ug/ml。取2ml 一系列浓度（0、2、4、6、8、10ug/ml）的脯氨酸标准液分别加入1ml 3%磺基 水杨酸+1ml冰醋酸+2ml 2.5%酸性茚三酮，置沸水浴中显色反应60min。冷却至室温后 向其加入4ml甲苯，振荡萃取红色物质，静止后取上层甲苯层，于520nm处测定OD 值。以脯氨酸浓度为X，以OD520为Y，绘出标准曲线或计算出脯氨酸浓度与OD520之 间的线性回归方程。2、可溶糖含量的测定原理：本试验采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量。糖在H2SO4作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作 用生成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。在625nm波长下的OD值与糖含量
6、呈正比。 由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。因 此可利用该性质来测定植物组织中可溶性总糖的含量。步骤：2、可溶糖含量测定：水提取液0.2毫升+0.8毫升无水乙醇+蒽酮试剂3ml，90。 下保温15min，冷却后于620nm处比色。所需试剂及配置：1、蒽酮试剂：150mg蒽酮溶于100ml 76%的稀硫酸中。2、76%的稀硫酸:76ml浓硫酸加到30ml超纯水中。注意事项：蒽酮试剂应现用现配并保存于棕色试剂瓶中。配制硫酸溶液：准备2000毫升大 烧杯，先向其中加入所需水量，然后再缓缓向水中加入浓硫酸，切记！ 含量计算：可溶糖含量（Amol/g.DW）=
7、（吸光值-0.0352）*1000/（0.21*样品质量*342）3，游离Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+等阳离子和阴离子测定将上述水提取液稀释若干倍（通过预实验确定），直接用原子吸收分光光度计测 定阳离子。用师大离子色谱测定阴离子（NO3-, C1-, H2PO4-, SO,）含量4矿质元素含量的测定4.1总氮含量测定用凯氏定氮方法。称取0.1克干样，消化，然后滴定。可查阅试验指导。消化液还可以稀释若干倍后测定Ca、Mg、Fe、Mn、Zn等金属元素含量(用原子吸 收分光光度计)。4.2金属元素含量测定(另一消化方法)提取方法：H2SO4-H2O2-HC1O4消煮法：准确称取干样品0
8、.1g，放入凯氏烧瓶底 部，加入3ml浓H2SO4和几粒玻璃球。放在表面温度为500C的电热板上炭化或 油浴(与凯氏定氮消化方法相同)约15分钟取下，放在石棉垫上冷却至约100C, 加入1ml 30%的H2O2，摇转后再在电热板上消煮，待H2O2蒸完后再冷至约100C, 再加1ml H2O2消煮，蒸去H2O2后稍冷，添加1m160% HC1O4，继续消煮至清亮 为止。冷至室温后将消化液移入25ml容量瓶中用去离子水定溶，即为待测液， 注意定容的时候将消化管中的粘有的消化液反复洗出，减少误差。注意如果用凯氏定氮消化瓶消化样品，则上述H2SO4-H2O2-HClO4用量可加倍.测定方法：Ca、Mg
9、、Fe、Mn、Zn，Cu用原子吸收光谱仪测定。P元素用钼蓝 比色法测定。含量计算：元素含量(mmol/g.DW)=测定值(ug/ml)*稀释倍数*提取液总体积(ml) / 分子量 (g/mol)* 取样量(g)*10004. 3 P元素测定钥蓝比色法：原理：在酸性条件下，无机磷可与钼酸铵作用生成磷钼酸铵，并被还原型Vc还 原成亮蓝色的钼蓝络合物，由颜色的深浅即可测定磷的含量。试验步骤：取消煮待测液0.4ml+5ml钼酸氨-硫酸混合溶液+2毫升3%Vc沸水浴 中反应15分钟，于700nm处比色所需试剂及配置：1、钼酸铵-硫酸混合溶液：称取25g钼酸铵于大烧杯中，加入200ml去离子水溶 解。将2
10、80ml浓硫酸慢慢倒入400ml去离子水中，冷却。然后把上述配好的 钼酸铵溶液加入此硫酸溶液中并用去离子水稀释至1L。2、3%Vc溶液(质量/体积)P含量计算：P含量(gol/g.DW) = (721.79*吸光值-3.1077) *稀释倍数*提取液总体积(ml) / 分 子量*样品质量(g)*.5，总氨基酸含量测定提取方法同脯氨酸 取0.25ml水提取液加入3ml茚三酮试剂，再加入0.1ml抗坏血酸。沸水浴15min，冷却后 于530nm处比色测吸光值（OD）。计算公式如下：氨基酸含量（“mol/g DW）=（吸光值 -0.0068）*10*1000/（13038*样品质量）药品配制茚酸酮试
11、剂：1.2g重结晶的茚三酮，加入15ml正丙醇，摇匀，使之溶解，后加入30ml正 丁醇和60ml乙二醇，混匀。再加9ml pH5.4的醋酸缓冲液，混匀。保存于棕色瓶中，置冷 凉处，适用期限10天；1%抗坏血酸配制方法：1g加入100ml纯水中。6,甘露醇含量测定甘露醇含量测定方法：取0.5ml水提取液，加入0.5ml超纯水，再加入1ml高碘酸钠（室温 静置10 min）。再加入2ml鼠李糖，混合后再4ml新鲜配制的Nash试剂,53C水浴加热15 min 使其显色，冷却后于413nm处比色，测吸光值。甘露醇含量 （冲ol/g.DW）=（吸光值-0.0036）*1000/ （10.4*40*样品
12、质量*182.17）药品配制高碘酸钾溶液的配制方法:0.3207g高碘酸钠+0.12mol/L盐酸100ml，配制成100ml的高碘 酸钾溶液。鼠李糖溶液的配制方法：0.1002g鼠李糖定容到100ml。Nash溶液的配制方法:15g乙酸铵+0.2 ml冰乙酸+0.2毫升乙酰丙酮定容至100 ml.7, 20种游离氨基酸含量：最后测定：用水提取液，用氨基酸分析仪测定。8根活力测定药品配制：0.4%TTC, 0.4克TTC溶于100毫升蒸馏水中，遮光保存。十五分之一磷酸缓冲液配制参考试验指导 测定：1.取新鲜根0.5克左右，放入试管中，向其中加入5毫升0.4%TTC, 5毫 升磷酸缓冲液，37度遮光反应1个小时。然后向其中加入2毫升1mol/L硫酸终 止反应。2.将根捞出，用滤纸吸干，放入13毫升带盖离心管中，向其中加入10毫升乙 酸乙酯，黑暗侵泡1-2天，待根变白。3取2中红色溶液485nm比色4标准曲线配制：取0.4%TTC 0.2毫升+9.8毫升乙酸乙酯，向中加少量Na2S2O4 反应生成TTF （反应产物）母液，TTF浓度80ug/ml。然后用乙酸乙酯将其稀释成0.05, 0.1，0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6倍，485nm比色， 建立吸光值与TTF浓度之间的方程，然后计算根活
