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1、ICS67.140CCSX 5534 安徽省地方标准DB34/T 42682022发酵茶中B 族和G 族黄曲霉毒素的测定Determination of aflatoxin B and G groups in fermented tea2022 - 08 - 31 发布2022 - 09 - 30 实施安徽省市场监督管理局发 布前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由安徽农业大学提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：安徽农业大学
2、、安徽省茶业集团有限公司、肥西县农业综合服务中心、云南微生物研究所。 本文件主要起草人：周育、管道健、张海柱、唐蜀昆、张梁、王希春。 发酵茶中 B 族和 G 族黄曲霉毒素的测定1 范围本文件规定了发酵茶中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G（2AFB2、AFG1和AFG2）的测定方法。 以下简称AFB1、本文件第一法为双柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生法，适用于发酵茶中黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1和AFG2含量的测定。 本文件第二法为双柱净化-液相色谱柱串联质谱法，适用于发酵茶中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2含量的测定。 2 规范性引用文件下列文件中
3、的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 5009.22 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定 3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。 4 第一法 双柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生法原理试样中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液经多功能净化柱和免疫亲和柱净化和富集，净化液经浓缩、定容和过滤后，经液相色谱分离，柱后光化学法衍生，荧光检测
4、器检测。外标法定量。 试剂及材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.2.1 试 剂4.2.1.1 甲醇（CH3OH，CAS：67-56-1）：色谱纯。 4.2.1.2 乙腈（CH3CN，CAS：75-05-8）：色谱纯。 4.2.1.3 氯化钠（NaCl，CAS：7647-14-5）。 4.2.1.4 磷酸氢二钠（Na2HPO4，CAS：7558-79-4）。 4.2.1.5 磷酸二氢钾（KH2PO4，CAS：7778-77-0）。 4.2.1.6 氯化钾（KCl，CAS：7447-40-7）。 4.2.1.7 盐酸（HCl，CAS：7647-
5、01-0）。 4.2.1.8 吐温-20（C58H114O26，CAS：9005-64-5）。 4.2.1.9 硫酸镁（MgSO4，CAS：7487-88-9）。 4.2.1.10 聚乙烯基吡络烷酮（PVP，CAS：9003-39-8）。 4.2.1.11 N-丙基乙二胺（PSA，CAS：111-39-7）。 4.2.2 材料4.2.2.1 移液管：1 mL 和 5 mL 规格。 4.2.2.2 针筒式滤器：100 mL 规格，可连接于空气压力泵或手动加压。 4.2.2.3 玻璃纤维滤纸：快速、高载量、液体中颗粒保留 1.6 m。 4.2.2.4 真菌毒素多功能净化柱（以下简称多功能净化柱）。
6、 4.2.2.5 免疫亲和柱：AFB1 柱容量 200 ng，AFB1 柱回收率80%，AFG2 的交叉反应率80%。 4.2.2.6 一次性针式过滤器：带 0.22 m 有机相微孔滤膜。 4.2.3 试剂配制4.2.3.1 乙腈-水溶液（84+16）：取 840 mL 乙腈加入 160 mL 水，混匀。 4.2.3.2 甲醇-水溶液（70+30）：取 700 mL 甲醇加入 300 mL 水，混匀。 4.2.3.3 磷酸盐缓冲溶液（以下简称 PBS）：称取 8.00 g 氯化钠、1.20 g 磷酸氢二钠、0.20 g 磷酸二氢钾、0.20 g 氯化钾，用 900 mL 水溶解，用盐酸调节 p
7、H 至 7.4，用去离子水定容至 1000 mL。 4.2.3.4 含 1% 吐温-20 的 PBS：取 10 mL 吐温-20，用 PBS 定容至 1000 mL。 4.2.4 标准品4.2.4.1 AFB1 标准品（C17H12O6，CAS：1162-65-8）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。 4.2.4.2 AFB2 标准品（C17H14O6，CAS：7220-81-7）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。 4.2.4.3 AFG1 标准品（C17H12O7，CAS：1165-39-5）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
8、4.2.4.4 AFG2 标准品（C17H14O7，CAS：7241-98-7）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。 4.2.5 标准溶液配制4.2.5.1 标准储备溶液分别称取AFB1、AFB2、AFG1 和AFG2 各1 mg（精确至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至 100 mL。各溶液浓度为 10 g/mL，溶液转移至试剂瓶中后，在 -20 下避光保存、备用，有效期三个月。临用前， 参照 GB 5009.22 进行浓度校准。 4.2.5.2 混合标准工作液（AFB1 和 AFG1：各 100 g/L，AFB2 和 AFG2：各 25 g /L)移液管准确移取AFB
9、1和AFG1标准储备溶液各 1 mL，AFB2和AFG2标准储备溶液各 250 L 至 100 mL容量瓶中，乙腈定容。密封后避光 -20 下保存，一个月内有效。 4.2.5.3 标准系列工作溶液稀释准确移取混合标准工作液，按照样品检测需求，以乙腈为溶剂作适度的梯度稀释，以符合分析检测要求。 仪器和设备4.3.1 高速粉碎机。 4.3.2 涡旋振荡器或摇床。 4.3.3 天平：感量 0.01 g 和 0.00001 g。 4.3.4 涡旋混合器。 4.3.5 离心机：转速 6000 g。 4.3.6 固相萃取装置：配 15 mL-50 mL 免疫亲和层析针筒。 4.3.7 空气压力泵。 4.3
10、.8 氮吹仪。 4.3.9 液相色谱仪：配荧光检测器。 4.3.10 液相色谱柱。 4.3.11 黄曲霉毒素光化学柱后衍生器。 4.3.12 筛网: 1 mm2 mm 试验筛孔径。 分析步骤4.4.1 取样4.4.1.1 茶汤采样量需大于 1 L，将所有液体样品在一个容器中混匀后，取其中任意的 100 mL 样品，供检测用。 4.4.1.2 干茶采样量需大于 1.0 kg，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于 2 mm，混合均匀后，以四分法缩分至 100 g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。 4.4.2 提取4.4.2.1 茶汤取 50 mL 试样（精确至 0.01 mL），然后加入
11、50 mL 乙腈（精确至 0.01 mL），7.5 g 氯化钠（精确至 0.01g），涡旋 1 min，6000 g 离心 10 min，取上清液，再加入 50 mL 乙腈重复提取， 然后合并两次上清液，并加入 2 g 氯化钠（精确至 0.01 g），2 g 硫酸镁（精确至 0.01 g），5 g PVP（精确至0.01 g），2 g PSA（精确至0.01 g），6000 g 离心 10 min，上清液用玻璃纤维滤纸过滤，收取虑液备用。 4.4.2.2 干茶称取 5 g 试样（精确至 0.01g）于 50 mL 离心管中，加入 25 mL 乙腈-水溶液（4.2.3.1）或甲醇-水溶液（4.2
12、.3.2），涡旋混匀，置于涡旋振荡器或摇床中振荡 20 min，将茶叶及取提液全部转移至针筒式滤器，真空抽滤（或手动加压过滤）。收集全部提取液于离心管中，在 6000 g 下离心 10 min，上清液用玻璃纤维滤纸过滤，收取虑液备用。 4.4.3 净化4.4.3.1 多功能净化柱净化移取适量上清液，按多功能净化柱的操作说明进行净化，收集全部净化液，并确保净化液多于 4 mL。 4.4.3.2 免疫亲和柱净化4.4.3.2.1 上样液的准备用刻度移液管准确吸取上步的净化液 4 mL （茶汤样品 20 mL 或依据浓度适当调整），加入 46 mL 含 1% 吐温 -20 的PBS（使用甲醇-水溶液
13、作为黄曲霉毒素提取溶剂时，加入含 1% 吐温 -20 的PBS可减半加入），混匀。 4.4.3.2.2 免疫亲和柱准备将 2 6 条件下保存的免疫亲和柱从冷藏条件下取出，恢复至室温连接于固相萃取装置。 4.4.3.2.3 亲和层析净化和柱下部放置 5 mL 刻度试管，加入 2 mL 甲醇，以每秒1滴的速度洗脱免疫亲和柱，再用空气压力泵吹干免疫亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在 50 条件下，用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0 mL 甲醇-水溶液（45:55，V/V），涡旋 30 秒溶解残留物，过 0.22 m 有机滤膜过滤，收集滤液待测。 4.4.4 液相色谱参考条件高效液相色谱参考条件
14、如下： a) 流动相：A 相：水；B 相：甲醇； b) 等梯度洗脱条件：A 相：55%；B 相：45%； c) 色谱柱：C18 柱（柱长 250 mm 或 150 mm，柱内径 4.6 mm，填料粒径 5 m)，或相当者； d) 流速：0.8 mL/min； e) 柱温：40； f) 进样量：10 L； g) 光化学柱后衍生器； h) 激发波长：360 nm；发射波长：440 nm；i) 液相色谱图参见附录 A。4.4.5 定性检测试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准品色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在 2.5% 之内。 4.4.6 标准曲线制作待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液（4.4.3.2.1）移至 50 mL 注射器筒中 （或按照批次分批次移入 10 mL-20 mL 注射器筒），调节下滴速度，控制样液以每秒一滴的速度稳定流过免疫亲和柱。样液流完后，向注射器筒内加入 10 mL 含 1% 吐温 -20 的PBS，以每秒 2 滴的流速淋洗免疫亲和柱，并重复一次净化
