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1、质粒DNA的提取、纯化和电泳检测姓名 学号 同组人 班级 实验时间摘要：质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA，它是基因工程中一种非常重要的载体。质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。碱变性提取法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。本次实验利用碱变法对E.coli DH5受体菌中质粒pUC19的DNA进行提取、纯化和电泳检测，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化及琼脂糖凝胶电泳技术。通过此次实验，我们达到了预期效果
2、。关键词：质粒DNA、碱变性提取法、质粒DNA的纯化、DNA凝胶电泳1.引言质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外，另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。由于质粒分子小、便于分离和提取的特点，在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带目的基因进入细
3、菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，因此质粒是基因工程中一种非常重要的载体。质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。因此，质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分
4、离目的，适用于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。在pH12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒DNA的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当用pH值4.8的KAc（或NaAc）高
5、盐缓冲溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分
6、子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱
7、基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素：（1）样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。（2）DNA分子的构象：分子量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA（cccDNA）的一条
8、链断裂，变成开环DNA（ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA（Liner DNA）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型（cccDNA）迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状（ocDNA）分子。（3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度愈低，则凝胶孔径愈大，DNA电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。（4）电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快，但随着电场强度增加，高分子量DNA的泳动速率以不同幅度增
9、加，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减小，为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V/cm。（5）电泳缓冲液: 在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。电泳缓冲液的作用：维持合适的pH。电泳时，正极发生氧化反应（4OH-+4e-2H2O+O2），负极发生还原反应（4H+4e-2H2），长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变；使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.010.04mol/L的Na+离子
10、，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化；电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为12mM，目的是螯合Mg2+等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。电泳缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率，当电泳液为无离子水（如不慎在凝胶中忘记加缓冲液，即误用蒸馏水配置凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错用10电泳缓冲液），导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。（6）温度：DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响不明显。不同大小DNA
11、片段的相对电泳迁移率在430内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0.5时凝胶很脆弱，最好在4下电泳以增加凝胶强度。2.材料和方法2.1 材料和试剂实验材料：E.coli DH5受体菌（生长在LB固体培养基）、有Amp标记的质粒pUC19实验试剂：LB液体培养基、氨苄青霉素（Amp）母液（储存浓度100mg/mL）、溶液、溶液、溶液、TE缓冲液、Tris饱和酚、氯仿/异戊醇混合液、酚/氯仿/异戊醇（PCI）（25：24：1）混合液、3M NaAc溶液、冰乙醇、70%乙醇、RNase A、灭菌双蒸水ddH2O、50TAE缓冲液、10mg/mL溴化乙锭（EB）溶液、6上样缓
12、冲液（6loading buffer）、琼脂糖、Supercoiled DNA Ladder Marker、pUC19、pUC19/Hind实验仪器：接种环、三角瓶、天平、红盖瓶、酒精灯、恒温振荡培养箱、100mL离心管、1.5mL塑料离心管、4离心机、涡旋振荡器、微量移液器、不同型号枪头、制胶板、制胶槽、样品梳、电泳仪、紫外灯、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、记号笔、盛冰的搪瓷杯、离心管架、手套2.2 方法2.2.1 E.coli DH5（pUC19）菌体培养（1）用Amp母液和LB液体培养基配制LB+Amp（Amp工作浓度为100g/mL）液体培养基。（2）用酒精灯灼烧且冷却后的接种环在LB固
13、体培养基上挑取E.coli DH5单菌落，将接种环伸至LB+Amp液体培养基中，在液体培养基与三角瓶瓶壁交界面处向液体培养基中接种E.coli DH5（pUC19）。（3）将培养基在37、200rpm下振荡培养过夜。（4）从过夜培养基中取1%接种量接种到新的LB+Amp（Amp工作浓度为100g/mL）培养基，将新的培养基在37、200rpm下振荡46小时，最后得到菌液。2.2.2 碱裂解/变性法提取质粒DNA（1）取出一支灭菌的100mL离心管，标记上组号，用天平称量其重量，并记录为W1。（2）向100mL离心管中倒入菌液至距瓶口1/3处，每两组的两支100mL离心管配平。（3）将菌液在4离
14、心机中6000rpm离心5min，弃上清。（4）向菌液中加入5mL溶液，涡旋振荡，将菌液在4离心机中6000rpm离心5min，弃上清。（5）将100mL离心管称重，标记其质量为W2，计算W2-W1。（6）每100mg菌体量，加入（按菌体量接近的重新分组，溶液补平）：1.0mL溶液，充分涡旋振荡，用溶液再次配平；2.0mL溶液，轻柔颠倒混匀，冰浴35min；1.5mL溶液，轻柔颠倒混匀，冰浴5min。（7）将菌液在4离心机中12000rpm离心15min，小心转移上清到新的离心管内，记录体积V。（8）加入2V冰乙醇，颠倒混匀；-20静置15min。（9）将菌液在4离心机中12000rpm离心1
15、5min，弃上清。（10）加入5mL 70%乙醇，12000rpm离心3min，吸弃上清。（11）重复70%乙醇洗涤一次，37风干510min。（12）分次加入1mL TE溶液并转移到EP管中，得质粒DNA粗提物。（13）向质粒DNA粗提物中加入5L RNase A（10mg/mL），终浓度为50g/mL，37孵育12小时。2.2.3 质粒DNA的纯化将1mL质粒DNA粗提物分出500L到一新EP管中，使得每组两管。每个EP管进行如下操作：（1）加入等体积的Tris饱和酚，涡旋振荡，12000rpm离心5min；（2）转移上清（上清体积是V1）至新管，加入V1的酚/氯仿/异戊醇混合液，涡旋振荡
16、，12000rpm离心5min；（3）转移上清（上清体积是V2）至新管，加入V2的氯仿/异戊醇混合液，混匀，12000rpm离心5min；（4）转移上清（上清体积是V3）至新管，加入1/10V3的3M NaAc溶液（pH=5.2），再加入2V4（V4=V3+1/10V3）的冰乙醇，混匀，-20保存30min；（5）12000rpm离心15min，弃上清；（6）加入500L 70%乙醇洗涤，12000rpm离心2min，弃上清；（7）重复洗涤一次，吸弃上清，37风干5min；（8）每管加入25L TE溶解沉淀，合并，得50L纯化质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA（1）1%琼脂糖凝胶的制备。配制2L1TAE：取40
