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1、银杏叶及其制剂中黄酮苷及内酯类活性成分含量测定方法研究进展【关键词】 银杏叶制剂；黄酮苷；内酯类；含量测定；综述银杏叶为银杏科银杏属植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶1-2,主要药理作用是改善心脑血管循环、解痉和抗过敏、抗菌、抗病毒及抗癌,临床主要用于治疗冠心病、心绞痛、高血压、高血脂及脑血管痉挛等症,还具有降血浆粘度、减少血栓塞及动脉硬化等作用,可以预防中风和心肌梗死3。银杏叶的主要化学成分为黄酮类和内酯类,黄酮类有20余种化合物,主要是槲皮素、山柰酚、异鼠李素的单糖、双糖、三糖及糖分子上接有桂皮醛的苷；内酯类主要有二萜类内酯、银杏内酯(ginkgolide)A、B、C及少量的
2、J、M以及倍半萜内酯、白果内酯(bilobalide)4。2005版中国药典(一部)规定总黄酮醇苷(以槲皮素+山柰素+异鼠李素的含量2.51计)不得少于0.40%,萜类内酯(以银杏内酯A、B、C和白果内酯的总含量计)不得少于0.25%。现将银杏叶及制剂的含量测定方法综述如下。1 黄酮类1.1 高效液相色谱法(HPLC) 佘氏等5采用色谱柱U BoudapakTM C18,流动相：甲醇-0.4%磷酸(6040),检测波长：266 nm。供试品溶液制备：精密称取银杏叶粗提取物适量,采用超临界流体萃取,在压力41 364 Pa、温度60 下,静态萃取4 min,动态萃取4 min,萃取完毕定容至10
3、 mL,将萃取液置于50 mL烧瓶中,加入1.5 mL 25%盐酸溶液,混匀,水浴回流30 min,迅速冷却至室温,然后转移至25 mL量瓶中,加甲醇定容。测得檞皮素、山柰酚含量分别为0.609、0.472 mg,总黄酮苷为2.78 mg。檞皮素、山柰酚加样回收率分别为96.23%、94.81%,RSD分别为2.41%、3.27%(n=3)。 王氏等6采用Sperisorb C18色谱柱,检测波长：360 nm。供试品溶液的制备：取银杏叶缓释胶囊20粒内容物,研细,精密称取约400 mg,精密加入甲醇25 mL,超声波提取20 min,滤过,弃去初滤液,取续滤液5 mL,水解条件与文献5相同。
4、测得三批样品总黄酮含量在28.9430.14 mg之间,槲皮素、山柰素、异鼠李素加样回收率分别为100.14%、97.55%、101.06%, RSD分别为1.01%、2.20%、2.09%(n=5)。 文献7-12采用的流动相、检测波长、供试品溶液的制备与文献5-6基本一致。提取部分不相同之处有的用甲醇、乙醇提取,有的用氯仿提取,但水解部分基本相同。 钱氏等13采用U Bondapak C18色谱柱,并加zorbax DDL预柱,流动相A为甲醇,流动相B为0.4%磷酸溶液,梯度洗脱。检测波长：365 nm。供试品溶液的制备：取银杏叶提取物75 mg,加甲醇30 mL、25%盐酸5 mL直接水
5、解,结果银杏总黄酮含量为27.18%31.03%,加样回收率为98.82%,RSD=3.94%(n=5)。 袁氏等14采用Hypersil ODS色谱柱,流动相：磷酸缓冲液(pH 2)-四氢呋喃-甲醇-异丙醇(60151015),紫外检测波长：380 nm。供试品溶液的制备：称取天保宁银杏叶片10片,研磨,精密称取适量于三角瓶中,分别加甲醇20 mL,超声溶解20 min,过滤,取续滤液10 mL置100 mL 锥形瓶中,加甲醇10 mL,盐酸5 mL,摇匀,加热回流30 min,冷却。结果测定样品中总黄酮含量在7.257.54 mg之间,槲皮素加样回收率99.06%,RSD%=1.33；山柰
6、酚加样回收率99.89%,RSD%=2.21；异鼠李素加样回收率99.06%,RSD%=1.85。1.2 薄层扫描法 李氏等15采用硅胶G薄层板,展开剂：氯仿-苯-无水乙醇-冰乙酸-水(5.5210.51)410 放置的下层溶液,显色剂：8%三氯化铝乙醇溶液,日光与紫外光(365 nm)下显黄色或黄绿色斑点,扫描条件：反射法锯齿扫描：s=370 nm,R = 650 nm,sx=3。供试品溶液制备：准确取银杏叶样品粉末4 g,置索氏提取器中,用氯仿70 mL回流后,弃去氯仿,用甲醇提取,水解部分与文献5相同,提取液通过聚酰胺柱,加蒸馏水150 mL洗脱后,弃去,用250 mL丙酮-甲醇(73)
7、洗脱,洗脱液蒸干,用丙酮20 mL定容即得。测得异鼠李素含量0.100 1%、山柰酚含量0.260 1%、檞皮素含量0.226%。加样回收率：异鼠李素、山柰酚、槲皮素分别为96.0%、99.6%、98.9%,RSD分别为2.03%、1.03%、2.10%(n=3)。1.3 近红外漫反射光谱法 胡氏等16采用近红外光谱技术直接测定银杏叶提取物中总黄酮的含量,比HPLC法快速、方便,结果准确,可以应用于提取中间控制与大批量产品的检测。应用主要成分分析法(PCR)、偏最小二乘法(PLS)、改进偏最小二乘法(MPLS)等回归模型与HPLC测定,再与近红外漫反射光谱数据进行回归分析。结果HPLC测定值在
8、24.11%30.37%之间,近红外光谱测定值在24.13%30.93%之间,样品回收率为96.15%102.1%, RSD=1.1%。1.4 超临界液体色谱法 王氏等17采用Dikma Diamonsil C18色谱柱,流动相：超临界CO2-0.05%三氟乙酸的乙醇(101),检测波长：360 nm。供试品溶液制备：称取银杏叶提取物150 mg,置100 mL量瓶中,用乙醇溶解并定容,过滤即得。结果测得槲皮素含量为13.88%,加样回收率为99.2%,RSD=2.3%(n=6)。2 内酯类2.1 HPLC法 张氏等18采用Symmotry C18色谱柱,流动相：甲醇-水(2674)。供试品溶
9、液的制备：称取银杏叶提取物100 mg,置于索氏提取器中,用25 mL乙酸乙酯回流2 h,将提取液真空干燥,剩余物用流动相溶解并定容至10 mL,即得。测得银杏内酯GA、GB、GC、GJ和白果内酯BB含量分别为2.627%4.305%、1.570%1.958%、0.9641.651%、0.208%0.493%、0.070%0.751%,回收率分别为97.4%、96.8%、94.9%、94.5%、93.2%,RSD分别为0.41%、0.53%、0.60%、0.47%、1.3%。 叶氏等19采用YWG-C18色谱柱,流动相：甲醇-水-四氯呋喃(20755)。供试品溶液的制备：精密称取银杏叶提取物约
10、500 g,置500 mL三角瓶内,加乙酸乙酯25 mL,超声波处理10 min,放置滤过,精密量取续滤液15 mL,通过聚酰胺小柱1.0 g,用乙酸乙酯20 mL洗脱,洗脱液蒸干,残渣用甲醇溶解并定容于5 mL,用0.45 m微孔滤膜过滤即得。测得银杏内酯A、B、C及白果内酯含量分别为1.85%3.59%、0.91%2.68%、1.21%1.36%、0.57%3.39%、2.66%9.89%。 张氏等20采用Hypersil ODS色谱柱,流动相：23%磷酸。供试品溶液的制备：取银杏叶片15片,去糖衣后粉碎,称取适量,用5%双氧水100 mL回流1 h,滤过,滤液用醋酸乙酯萃取,萃取液用1%
11、 NaHCO3水溶液萃取多次,后用1% Na2SO3水溶液萃取,醋酸乙酯液继续用水和5% NaCl萃取,回收提取液用50%甲醇定溶于25 mL容量瓶中,即得。测定萜类总内酯在1.853.04 mg/mL之间,银杏内酯A、B、C及白果内酯加样回收率分别为91.5%、101.65%、103.12%、104.3%,RSD分别为2.28%、2.62%、2.2%、1.12%(n=5)。 汪氏等21采用C18色谱柱,流动相：甲醇-水-磷酸(25750.1)。供试品溶液的制备：银杏叶提取物溶于30%乙醇,溶解后用乙酸乙酯萃取,溶液浓缩后用HPLC分析,回收率大于99%,RSD2.0%。 王氏等22采用色谱柱
12、YWG-C18,采用的流动相和供试品溶液的制备与文献19一致,测得国内外20个厂家的银杏叶片中的银杏内酯A、B、C和白果内酯及总内酯含量分别为0.4111.546、0.2210.842、0.3990.602、0.0431.253、0.4612.597 mg/片。白果内酯及银杏内酯A、B、C的平均回收率分别为98.34%、96.79%、96.72%、97.37%,RSD分别为1.87%、3.71%、3.96%、1.88%(n=6)。 郝氏等23采用蒸发光散射法测定银杏叶缓释片中萜类内酯的含量,采用DiamonsilTM ODS色谱柱。供试品溶液制备：取银杏叶缓释片20片,称取适量,于三角瓶中,用
13、5 mL甲醇超声波提取20 min,离心,上清液用0.4 m滤膜滤过,用小柱萃取,将C18小柱接于蠕动泵上,以5.0 mL甲醇和水顺序冲洗,然后准确吸取对照液或供试品溶液0.5 mL,通过C18小柱,接头用2.0 mL水冲洗,继用2.0 mL甲醇-水(6040)洗脱,弃去初滤液,取0.61.5 mL续滤液于量瓶中,加甲醇定容至10 mL即得。测得萜类内酯含量为20.621.3 mg/g。 张氏等24采用汉邦Lichrosper C18色谱柱,流动相：正丙醇-四氢呋喃-水(11584)。供试品溶液的制备,取银杏叶软胶囊20粒内容物,混匀,精密称定适量,加水10 mL,加2%盐酸2滴,用乙酸乙酯提
14、取,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20 mL洗涤,分取醋酸钠液,用乙酸乙酯10 mL洗涤。合并乙酸乙酯液,用水洗涤2次,合并水洗液,用乙酸乙酯10 mL洗涤,合并乙酸乙酯液,回收至干,残渣用丙酮溶解并定容于5 mL量瓶中,即得。测得银杏内酯A、B、C及白果内酯、总内酯含量分别为1.251.32、0.680.71、1.181.23、2.232.28、5.405.49 mg。加样回收率测定银杏内酯A、B、C和白果内酯之平均值为97.1%,RSD=1.71%(n=9)。 刘氏等25采用流动相和供试品溶液的制备与文献24基本一致。共测定3批银杏口腔崩解片中萜类内酯的含量,分别为7.31、7.33、7.3
15、2 mg/片。银杏内酯A、B、C及白果内酯平均回收率分别为99.9%、100.7%、100.0%、100.1%,RSD分别为2.9%、3.0%、1.8%、2.6%。2.2 薄层扫描法 陆氏等26采用Kieselgel 60 GF254薄层板,展开剂：乙酸乙酯-甲苯-丙酮-正己烷(4321),展开后显色。扫描条件：单波长反射法锯齿扫描：s=270 nm,sx=3。供试品溶液的制备：精密称取银杏叶浸膏50 mg,加甲醇适量,超声波振荡75 min,放置,定容1 mL即得。测得白果内酯含量在0.31%1.36%之间,加样回收率为99.83%,RSD=1.78%(n=5)。 颜氏等27采用硅胶H加0.4%醋酸钠的0.5%CMC-Na薄层板,展开剂：甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(52.52.50.3),展开,取出,晾干,用醋酸蒸气熏30 min后,160 加热30 min,取出放置,用荧光方式(ex=365 nm)进行扫描,以多点校正,多项式回归计算含量。供试品溶液的制备：取银杏叶浸膏片剂10片,研细,精密称定约1 g,置50 mL离心管中,加甲醇30 mL,超声波150 min,合并提取液,蒸干,残渣用水溶解,加至预先处理的聚酰胺小柱上,用水150 mL
