《SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、SDS-PAG电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 （简称Acr）和交联剂N, N -亚甲基双丙烯酰 胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并 以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的 差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带， 如果分 离纯化的样品中只含有同一种蛋白质， 蛋白质样品电泳后， 就应只分离出一条区 带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物， 使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电 荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白
2、质-SDS 复合物在电泳时的迁移率， 不再受原有电荷和分子形状的影响， 而只是棒长的函数。 这种 电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称 SDS-PAGE。由于SDS-PAGE可 设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度， 因此 常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度， 如果被鉴定的蛋白质样品很纯， 只含有 一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么 SDSPAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚 合。过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。SDSPAGE 可
3、分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采 用垂直板状不连续系统。所谓 “不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲 液、 pH 和凝胶孔径等所组成。1. 蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液 （Tris-Gly,、浓缩胶缓冲液 （TrisHCI,、分离胶缓冲液（Tris-HCI,两种凝胶的浓度（即孔径）也不相同。在 这种条件下，缓冲系统中的HCI几乎全部解离成Cl-，两槽中的Gly （pl=, pK a= 只有很少部分解离成 Gly 的负离子, 而酸性蛋白质也可解离出负离子。 这些离子 在电泳时都向正极移动。C1速度最快（先导离子），其次为蛋白质，Gly负离子 最
4、慢（尾随离子）。由于C1很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、 电位梯度较陡的区域， 该区电位梯度最高， 这是在电泳过程中形成的电位梯度的 不连续性，导致蛋白质和 Gly 离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前， 快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。2. 分子筛效应蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其 pH 升高（电泳进行时 常超过，使 Gly 解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响， 迁移率急剧下降。 此两项变化， 使 Gly 的移动超过蛋白质， 上述的高电压梯度不 复存在，蛋白质便在一个较均一的 pH 和电压梯度环境中，
5、按其分子的大小移动。 分离胶的孔径有一定的大小， 对不同相对分子质量的蛋白质来说， 通过时受到的 阻滞程度不同， 即使净电荷相等的颗粒， 也会由于这种分子筛的效应， 把不同大 小的蛋白质相互分开。SDS-PAG电泳胶配制：分离胶（12%）4ml8ml10mlH2OmlAcr/Bis(30% )mlTris-HCISDS(30%)40 gl80 gl100 glAP(10%)40 gl80 gl100 glTEMEDglgl100 gl水封30分钟浓缩胶（5%）2 ml4 ml5 mlH2OmlmlmlAcr/Bis(30% )mlTris-HClmlmlSDS(30%)20 gl40 gl50
6、 glAP(10%)20 gl40 gl50 glTEMEDglglglSDS-PAG试剂配制:试剂名称配制方法备注30% Acr/Bis29%（ w/v ）丙烯酰胺、1%（ w/v）N,N- 亚甲双丙烯酰胺、一般配置 100ml，称重Acr 29g,Bis 1g，加温热的去离子水 100ml， 溶解室温，藏于棕色瓶子，几个月需要重 新配制。具有强神经毒性，易吸附于 皮肤，配置是应带面具和手套。Tris-HClL,一般配置100ml，称重，加去离子水100 毫升，溶解须用Ttis碱，用HCI调节pHTris-HClL,一般配置100ml，称重，加去离子水100毫升，溶解须用Ttis碱，用HCI
7、调节pH10% SDS10%（ w/v），一般配置 100ml，称重 10g，加去离子水100ml，溶解不同厂家的SDS相差较大，建议用同一家的统一级别的试剂10%过硫酸铵（AP）10%（ w/v）,称重10g，加去离子水100ml，溶解过硫酸铵容易分解，建议隔周配置存 于4 C冰箱或者分装200 g，存于-20 CTEMEDTris-甘氨酸电泳缓冲液5 X缓冲液:25mmol/L Ttis 碱，250mmol/L 甘氨酸（电泳级，），%SDS配置：900ml去离子水，加 Ttis碱，94g甘氨酸，50ml 的 10% （w/v ） SDS溶液，补去离子水至1000ml5 x缓冲液：去离子水以1:4稀释后为1 x的缓冲液，可以重复使用3次左右
