藻类生物学实验室新生培训手册

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1、藻类光生物学实验室新生培训手册欢迎各位新生来到藻类光生物学实验室， 在这里你们将度过你们的研究生生 涯。为了使你们尽快融入实验室这个大家庭， 为了使你们今后能够更好的进行科 学研究，本实验室将对所有来到这里的新生进行为期 2 周的培训，希望大家能够 积极参与， enjoy it ！【培训内容】了解实验室规章制度及研究生须知掌握基本实验技术培训总结一 了解实验室规章制度及研究生须知 为了使实验室能够高效、有序的运转，藻类光生物学实验室制定了自己实验 室的规章制度， 每位在这个实验室学习工作的人员都必须遵守这些规章制度，同时，各位研究生还需要遵守研究生守则，以保证自己能够顺利毕业。培训方式：抄写并

2、熟知相关规则。培训时间：入学第一周第一天二 掌握基本实验技术 为了能够进行科学研究，一些基本实验技术的掌握是必须的，新生将在实验 室技术人员的指导下对实验技术进行熟练操作、 掌握。以下是藻类光生物学实验 室必须掌握的实验技术， 新生在进行实际操作前， 必须先对实验原理及步骤进行 预习。培训时间：开学第一、二周1. 海水二氧化碳系统各分量的计算：气态 CO2 溶入海水后，一方面服从亨利定律(在一定温度下，气体在液体中的饱和浓度与液面上该气体的平衡分压成正比)：C02(g) CO(aq)，因此C02的平衡溶解度C02与C02的平衡分压 pCO2之间的线性关系可表示为C 0 2 (aq)= KH*p

3、C02， KH 是海水中二氧化碳的溶解度系数与温度、盐度和压力有关；另一方面，C02还和水反应生成碳酸，C02+ H20 H2CO3,然后，H2CO3 分两步电离H2CO3JKT H+ + HCO3-_JK2 f CO3 细胞色素的定量 + 2H +K1= aH+HCO3-/H2CO3(1)2- -K2= aH+CO32-/HCO3-(2)Ki 、K2、分别是碳酸的第1、第2表观解离常数，其中HCO3J +2 CO32-=Ac(3)-5Ac为碳酸盐总碱度，它跟海水总碱度(At )有如下关系：Ac=At - 2.206 X 10 XCl %o X Kb 7 ( Kb + aH+)=At -BCl

4、%o是海水氯度，Kb 是硼酸的解离常数当海水温度、盐度确定时， KH、 K1、 K2、 B 值都可查表得到，这样通过测定 海水的 pH 和总碱度，按下列方程即可计算碳酸盐体系各组分 (HCO3-、 CO32-、 CO2*、ICO2)的浓度和 pCO2。由公式( 1 )( 2)和( 3)可得碳酸系统各组分计算公式：HCO3-=Ac/(1+ 2K2、/aH+)2-CO3 - = AcX(K2/aH+”(1+2K27aH+)CO2*= (AcXaH+/K1、/()1+ 2 K2、/aH+)BCO2= HCO3- + CO3_ + CO2*=AcX(1+K2、/aH+ aH+/K1、/()1+ 2 K

5、2、/aH+)pCO2= CO2*/KH因为海水中CO(aq)和H2CO3是无法区分的，所以用CO2*表示两者的总和， 以上各参数计算在软件 CO2 SYS 完成 (By ： Lewis, E., and D. W. R. Wallace. 1998. Program Developed for CO2 System Calculations. ORNL/CDIAC-105. Carbon Dioxide Information Analysis Center, Oak Ridge National Laboratory, U.S. Department of Energy, Oak Ridg

6、e, Tennessee。.)计算题：当温度是10C时，pH值为8.3的海水总碱度为2.5X10-3mol/L,盐度是31 %，查表得 B 值为 8X 10-5mol/L，CO2 溶解系数为 4.621 X 10-2mol/L/atm, pK 1、 和pK2分别是5.98和9.10，求海水中各种DIC组分的含量。2.1 叶绿素 a(chla )、叶绿素 c( chlc )和类胡萝卜素【实验原理】根据 chla 甲醇提取液在 665nm 处有最大吸收峰，利用分光光度计法测定 chla 的含量。【实验步骤】1) 将藻体置于一定量的甲醇中，放置于4 C的冰箱内过夜处理。2) 1500g离心10min

7、,取上清，用分光光度计测定其在750、665、652的 OD值。3) 按照 Porra 提供的公式,Chia(卩 g/m=16.29* (A665- A750) 8.54* (A652 A750) ，计算其含量。采用 Jeffrey& Haxo 的公式计算 chic 含量：chlc( pg/ml)=67.3 A635-14.1 A668A635和A668代表波长为635和668的吸收值。采用Strickland & Parsons的公式计算类胡萝卜素含量：Carotenoids(/ml)=7.6*(A 480 A750) -1.49*(A510 A750)2.2藻红(PE和藻蓝蛋白(PC1)

8、取约为 0.2g 的藻体，在研钵内加入一定量的石英砂和少量的磷酸缓冲 液(pH= 6.8)将藻体研碎，2) 加约10ml的磷酸缓冲液10000r/min离心10分钟，取上清液，将沉淀 物继续研磨，并重复上面的步骤，3) 最后将溶液定容为25ml，然后用分光光度计测定 A455、A564 A592、 A618和A645值。PE和PC的含量按下列公式计算：PE= (A 564-A592)-(A455-A592)* 0.2/0.12PC= (A618-A645)-(A592-A645)* 0.51/0.15注意事项： 1.藻体研磨要尽量充分，直至离心沉淀物基本无颜色。计算题：已知培养液中藻体的浓度是

9、105cells/ml,取10ml培养液，离心， 用5ml甲醇过夜处理后，离心取上清，测得其在750、665、652的OD值分别是0.001 、 0.0082、 0.0026，求单位细胞藻体中叶绿素含量。问答题 ：1. 为什么在测定叶绿素定量或扫描吸收光谱时，通常需要测定750nm 的吸光值？2. 色素定量的公式较多，采用不同计算公式，验证差别的大小。3. 色素的提取，是定量的关键， 如何确定提取是完全的？ 对于组织结 构负责的藻体，需将其研磨碎后提取， 应注意那些步骤？3.光合作用速率的测定3.1 C14 测定方法【实验原理】浮游植物光合固碳速率（初级生产力）依照 Steeman Niels

10、en（ 1952）发明的14C同 位素标记法来进行测定。浮游植物进行光合作用需要固定海水中的无机碳（DIC）,海水中碳元素是以HCOJ、CO2-、CO和H2CO等形式存在，它们之间存在动态平衡，可 以相互转化，这样当加入 H14CO3-时，经过培养之后，通过液闪计数可以计算浮游植物 固定了多少14C，再乘以溶液中DIC和H14CO3-的比例，可以推算浮游植物总共固定了 多少 DIC。【实验步骤】1） 进行光合固碳速率测定时，将取得的水样用180呵孔径的筛绢滤去浮游动物， 分装到体积为 20ml 的石英管中。2）然后用连续加样器（eppendof）吸取一定体积的14C液体，按每管100 pl （

11、放 射活度为5Qi）的加样量加入，盖上塞子摇匀后到室外接受阳光照射（或在太阳 模拟器下）。3） 石英管盖上或包裹上不同的膜以接受不同的阳光辐射处理，膜的类型因实验目 的的不同而不同，培养过程中用流水水浴控温（当以模拟器为光源时，用空调控 温），范围为土 2C,培养时间一般至少4小时。4） 培养完毕后将石英管拿回实验室内，每个石英管中的水样过滤到一张GF/F 直 径为 25mm 的玻璃纤维滤膜上，然后放入 20ml 的液闪瓶中。5） 最后将液闪瓶连同滤膜一起放入到一个密闭的塑料盒中，同时在盒中放一小瓶 约 15ml 的浓盐酸过夜， 利用浓盐酸形成的酸雾将滤膜上未被浮游植物利用的无机 14C （即

12、NaH14CO3）转化为气体形式去除。6）第二天将液闪瓶取出放入45C烘箱中烘干，储存。7）每个液闪瓶中加入闪烁液（ Optiphase Hisafe 3） 3ml8）放置 2-3h 后，置于液体闪烁计数仪（ Scintillation Counter, BeckmanCoulter,LS6500）中测定。浮游植物固碳量用下列公式计算：卩 gCL = （CPM L-CPMD）/Ce I池IC/ACPMl为接受阳光辐射处理样品中被固定的放射性物质的放射量（每分钟计数的数目）；CPMd为对照样品（暗瓶）中被固定的放射性物质的放射量；Ce为计数效率，液闪计数仪的计数效率通过测定14C的标准样品获得；

13、If为同位素差别因子，在CO2的固定过程中，细胞对14C和12C的利用率存在差异，12C与14C相比，其同化率快6%，故If为1.06；DIC 为培养液总溶解无机碳浓度；A为所加14C的每分钟裂变数（DPM）（等于所加14C活度（Q）沦2 X06）;固碳速率（酎C（ 4 chi a）-1h-1）由该固碳量除以叶绿素浓度及培养时间得到。【注意事项】：1） 由于NaCO在溶液中是一个平衡体系，所以样品尽量保存在低温下（4oC）以 防止溶液中 CO2 气体挥发，污染环境并影响测定结果。2）使用 C-14 进行实验操作时尽量远离， 尽量少呆在有污染的空间内， 并保持操 作空间通风良好，以尽量减少呼吸吸

14、入造成内辐射。3）样品处理是关键，否则会影响实验结果，甚至看到的实验现象为假象。得到 的样品酸化一定要充分 （酸不能重复使用，一般 2-3 次就要更换；酸化时间足 够，一般酸化过夜）；野外实验时，酸化后样品一般要烘干（或-20C）保存，烘 干温度不能超过60C（50-60C）,烘干时间6h。样品带回实验室测定时，加入 闪烁液后最好放置 2-3h 后测定，以便使样品充分消化，然后再进行计数。4） 加入C14的量与叶绿素浓度的关系（参考数值）：5 用 chla/L力卩 1 Q5）14C （Amersham bioscienee UK Limited），为 NaH14CO3浓缩液（12.5ml,总活

15、度25mCi即2mCi/ml）,使用前稀释到50 pCi/ml。具体操作为：先用普通滤纸预先过滤一 定体积的海水，再用直径50mm孔径0.47 m的微孔滤膜反复过滤。为防止在接下来的 灭菌过程中海水发生结晶， 加蒸馏水将其稀释到 80%，然后用此 80%的海水将 NaH14CO3 浓缩液稀释，115C下灭菌20分钟，保存于4C冰箱中备用。计算题：在20ml海水中加入5 Qi C-14,培养6小时后，过滤、酸化、烘干、加 入液闪计数，到得的数值是 CPMl是9754.4, CPMd是1034.8,已知液闪计数仪的计数 效率为0.96,海水中叶绿素浓度为0.32用/L, DIC浓度为2.2mM,求海水中浮游植物的 固碳速率（包C（伺chi a）-1h-1）。3.2氧电极法（开放系统法，封闭系统法，原理与测 CO2 一样， 见下）测定一段时间反应槽中溶解氧浓度的变化， 根据溶解氧浓度的变化、 引起变 化所需要的时间以及反应槽的容积可以计算光合作用速率。