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1、第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。一、酶和酶作用底物（一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化10低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。2. 碱性磷酸酶（ALP）:大肠杆菌来源的ALP分子量80kD,酶作用最适pH为8.0 ;小牛肠黏膜ALP分 子量为100kD,最适pH为9.6 ;后一种ALP的活性高于前者。3. 3 -半乳糖苷酶（3 -Gal ） : 3 -Gal来源于大肠杆菌，分子量 540
2、kD,最适pH6&因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于 均相酶免疫测定。（三）常用的底物1. HRP的底物 邻苯二胺（OPD :是HRP最为敏感的色原底物之一。 OPD在 HRP的作用下显橙黄色，加强酸如硫 酸或盐酸终止反应后呈棕黄色，最大吸收峰在492nm波长。OPD是ELISA中应用最早的底物，但其应用液稳 定性差，易变色，需新配制后在 1小时内使用，显色反应过程需 避光，而且具有致癌性。 四甲基联苯胺（TMB : TMB是一种优于 OPD的新型HRP色原底物。TMB经HRP作用后变为 蓝色， 加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长
3、为 450nm TMB具有稳定性好，成色 无需避光，无致突变 作 用等优点，已成为目前 ELISA中应用最广泛的底物。缺点是水溶性差。 其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS。2. ALP的底物常用对-硝基苯磷酸脂（p-NPP）,p-NPP经ALP作用后的产物为 黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为 405nm。3. 3 -半乳糖苷酶（3 -Gal ）的底物10用灵敏的光度计测定，反应的温度也需严格控制。最早取得临床实际应用的均相酶免疫试验是酶放大免疫 测定技术（EMIT），随着新的均相酶免疫试验的发展，目前最为成功的是克隆酶供体免疫测
4、定（CEDIA。（一）酶放大免疫测定技术（EMIT）EMIT的基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原。当与抗体结合 后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制。反应后酶活力大小与标本中的半 抗原量呈一定的比例，从酶活力的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。（二）克隆酶供体免疫分析（ CDEIA DNA重组技术可分别合成某种功能酶（如3 -D半乳糖苷酶）分子的两个片段，大片段称为酶受体（EA）,小分子称作酶供体（ED）,两者单独均无酶活性，一定条件下结合形成四聚体方具酶活性。克隆酶供体免疫测定（CDEIA）的反应模式为竞争法。测定原理为：标本中的抗原和酶供体（ED）标记的抗原与
5、特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与酶受体（EA）结合，而游离的 ED标记的抗原上的ED可和EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活性，酶活力的大小与标本中抗原含量成正比。二、异相酶免疫测定是目前应用最广泛 的一类标记免疫测定技术。（一）异相液相酶免疫测定主要用于检测样品中极微量的 短肽激素和某些药物等小分子半抗原。酶标志物具有更好的稳定性，且无放射性污染。异相液相酶免疫测定根据样品抗原加样顺序及温育反应时相不同而有平衡法和非平衡法两种。前者系 将待测样品（或标准品）抗原、酶标抗原及特异性抗体相继加入后，进行一次性温育，待反应达平衡后
6、， 再加分离剂。经离心沉淀后，吸弃上清（含未与抗体结合的游离酶标抗原），测定沉淀物（酶标抗原抗体 复合物）中加入酶底物液后的呈色吸光度值（ absorb -ance , A）,绘制标准曲线，即可测得样品中待检抗 原含量。非平衡法则是先将样品（或标准品）与抗体混合反应达平衡，然后加入酶标记抗原继续温育一段 时间，最后同平衡法进行分离游离、结合酶标志物并测定底物显色等步骤。一般而言，非平衡法可提高分 析测定的灵敏度。其测定灵敏度与放射免疫方法相近，近年有取代放射免疫方法的趋势。（二）固相酶免疫测定酶联免疫吸附试验（ELISA）。 第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理把抗原或抗体结合到固相载体表面，测
7、定时将受检样品和酶标记抗原或抗体按一定程序与结合在固相 载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物；洗去未结合成分；加入底物后，底物被固相载体上的酶催第3页共9页成固相抗原-受检抗体复合物；经温育洗涤后，加入酶标二抗，常用羊抗人IgG，在固相上即形成固相抗原 -待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。多用于检测IgG类型抗体。此外，该法只需更换固相抗原，就可用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性。但此法由于受血清中高浓度的非特异性IgG的干扰，通常待测标本需经一定稀释后才能测定。间接法测抗体在目前应用最多的是丙型肝炎病毒抗体、人免疫缺陷病毒抗体和
8、梅毒螺旋体抗体等的检测。2. 双抗原夹心法此法可检测各类抗体，因此双抗原夹心法的 灵敏度和特异性要高于间接法 。其原理类似双抗体夹心法， 操作步骤也基本相同，也可采用一步法，只不过由于机体产生抗体IgG的效价有限，一般 不会出现钩状效应。临床上乙型肝炎表面抗体的测定常用此法。3. 竞争法一般抗体检测是较少采用，当相应抗原材料中含有与抗人IgG反应的物质，而且不易得到足够的纯化第4页共9页个底物分子转变成有色产物。用于标记的酶应符合：1. 酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。2. 易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。3作用专一性强，酶活性不受样品中
9、其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源 性酶或抑制物。用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。4. 酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。5. 酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。（二）常用的酶1. 辣根过氧化物酶 （HRP :目前酶联免疫吸附试验中 应用最广泛 的标记用酶。由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ（ HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值）表示，RZ值应大于3.0
10、。RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。酶活性以单位 U表示：即1分钟将1卩mol底物转化为产物所需的酶量。酶变性后，RZ值不变但活性降酶结合物。酶结合物是酶免疫技术的核心组成部分。酶结合物的质量直接影响酶免疫技术的应用效果。（一）酶标记抗体或抗原的制备用于制备酶标志物的抗原要求纯度高，抗原性完整（半抗原应先与大分子载体蛋白交联）；抗体则不 仅需要特异性好、效价高、亲和力强以及比活性较高，而且还需要能批量生产和易于分离纯化。目前常根 据具体方法要求选用单克隆抗体、多克隆抗体经纯化的Ig组分、Ig的Fa
11、b和F （ab） 2片段等。酶标记抗体或抗原的方法有多种，标记方法一般应符合：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记 反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标志物稳定。标记方法有：1. 戊二醛交联法可以使酶与蛋白质或其他抗原的 氨基通过戊二醛偶联。一步法（连接 ALP,二步法（连接 HRP。（1）一步法优点：操作简便、有效，而且重复性好。缺点：交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。（2）二步法先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。优点：酶标志物质量较均一，标记效率也较一步法高。2. 改良过碘酸钠法HRP标记抗体或抗原的最常用方法 。（二）
12、酶标记物的纯化及鉴定常用的纯化方法有葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化和 50%包和硫酸铵沉淀 提纯等。常用免疫电泳 或双相扩散法 进行鉴定。1. 出现沉淀线表示酶标记物中的抗体（抗原）具有 免疫活性。2. 沉淀线经生理盐水漂洗后，滴加酶的底物溶液，若沉淀线上显色，则酶标记物中的 酶活性仍保留。三、固相载体固相载体是酶免疫技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法。（一）固相载体的要求 结合抗体或抗原的容量大；可将抗体或抗原牢固地固定在其表面，经长期保存 和多次洗涤也不易脱落；不影响所固定的抗体或抗原的免疫反应性，而且为使反应充分进行，最好其活性 基团朝向反应溶液，固相方法简便
13、易行，快速经济。（二）固相载体的种类和选择1. 塑料制品：聚苯乙烯塑料最常采用。此种材料具有很好的光透性和蛋白吸附能力，且很容易加工成试管、微孔板、微球、珠、膜等形状的固相，价格低廉。抗原或抗体以非共价或物理吸附 方式结合到此载体上。此类固相载体的主要缺点是抗体（抗原）结合容量不高、固相抗体（抗原）脱吸附率较高且不均一，孔间变异大，重复性差，从而影响测定的灵敏度、精确度及检测范围。目前采用非共价和化学偶联共价吸 附方法进行抗原或抗体的固相化可改善上述缺点。2. 微粒：可悬浮在溶液中，带有能与蛋白质结合的功能基团，形成化学偶联。自动化检测中常用。3. 膜载体：常有硝酸纤维素膜（Nc）、玻璃纤维素
14、膜及尼龙膜等通过 非共价键吸附抗体（抗原），广 泛用于定性或半定量斑点 ELISA的固相载体。第二节酶免疫技术的分类包括两种：酶免疫组织化学 技术：用于组织切片或其他标本中抗原的定位。酶免疫测定技术（EIA）:用于液体标本中抗原或抗体的定性和定量。EIA是用酶标记抗原或抗体作标志物用于检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。EIA反应系统中，酶标抗体（抗原）经反应后，可与相应的抗原（抗体）形成免疫复合物，通过测量复合物中标记酶催化底物水解呈色的颜色深浅， 可以推算待测抗原或抗体含量。根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标志物分离 ，EIA 一般可分为 均相和异相两种类型。一、均相
15、酶免疫测定利用酶标志物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变的原理，可以在不将结合和游离 酶标志物分离的情况下，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。该法主要用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定，均相法的优点是适合于自动化测定，但反应中被抑制的酶活力较小，需化变成有色产物。故：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶反应的底物三种试剂为反应必备。ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如肝炎病毒（甲肝抗体、“乙肝两对半”、丙肝抗体、丁肝抗体、 戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核分枝杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白 质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。二、方法类型及反应原理根据其测定抗原和抗体的不同而有不同的测定方法，抗原测定：蛋白大分子抗原用得最多的是双抗体 夹心法，而对于只有单个抗原决定簇的小分子，则使用竞争抑制法。抗体测定：通常使用间接法、双抗原 夹心法、竞争法和捕获法等。（一）检测抗原的方法1. 双抗体夹心法：属于非竞争结合，检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。原理是先将特异性抗体与固相载体连接；加入待测标本，形成固相抗原抗体复合物；再加入酶标抗体
