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1、-一种新型杀菌剂制备及性能研究完成日期：指导教师签字：辩论小组成员签字：一种新型杀菌剂制备及性能研究摘要本论文对高分子质量的壳聚糖进展分子修饰，在水浴条件下使一定量的壳聚糖、二甲基亚砜和碘甲烷在碱性环境中反响适当时间，合成一种N上取代季铵盐的壳聚糖抗菌剂，季铵盐壳聚糖。所得水溶性季铵盐壳聚糖TMC采用傅里叶红外光谱检测FT-IR进展表征和分析。研究TMC对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性能，以未修饰的壳聚糖作为对照。结果说明：TMC对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有一定的抑菌效果，而壳聚糖对两种受试菌则没有明显的抑菌效果。针对TMC筛选出中和试剂，卵磷脂。研究TMC与细菌接触作用5分钟，10分钟，
2、15分钟和20分钟时的抑菌效果。结果显示：接触时间越长，TMC的抑菌效果越好。本项研究对更好的开发利用季铵盐壳聚糖，使其成为成熟的杀菌剂具有十分重要的意义。关键词：壳聚糖；季铵盐；杀菌剂；中和剂The Preparation of A New Fungicide And Its PropertiesAbstractIn this paper, the polymer molecular mass of chitosan modified conditions under the water bath a certain amount of chitosan, dimethyl sulfo*id
3、e and methyl iodide an appropriate time in an alkaline environment, the synthesis of an N-substituted season ammonium salt of chitosan antimicrobial agent, a quaternary ammonium salt of chitosan. The resulting water-soluble quaternary ammonium salt of chitosan (TMC) using Fourier Transform Infrared
4、Spectroscopy (FT-IR) were characterized and analyzed. Study on the antimicrobial properties TMC Escherichia coli, Staphylococcus aureus, unmodified chitosan as a control. The results showed that: TMC for Escherichia coli and Staphylococcus aureus has certain inhibitory effect, while the two tested b
5、acteria Chitosan is no significant inhibitory effect. TMC screened for neutralizing agents, lecithin. Research TMC contact with bacteria for 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes and antibacterial effects of 20 minutes. The results show: The longer the contact time, the better inhibitory effect TMC. Stu
6、dy for a better e*ploitation of the quaternary ammonium salt of chitosan, making it a proven fungicide has very important significance.Key words: chitosan; quaternary ammonium salt; germicide; neutralizing agent目 录0前言41实验材料及仪器61.1实验材料与试剂61.2实验仪器62实验方法82.1季铵盐壳聚糖的合成82.2壳聚糖和季铵盐壳聚糖物的红外光谱表征82.3季铵盐壳聚糖的抑菌性
7、能检测82.3.1 培养基的配制及试剂的准备8菌株接种与培养9测定与分析102.4季铵盐壳聚糖中和剂的筛选102.5季铵盐壳聚糖的抑菌效能评价113实验结果分析123.1季铵盐壳聚糖物的红外光谱表征123.2季铵盐壳聚糖的抑菌性能检测123.3季铵盐壳聚糖中和剂的筛选143.4季铵盐壳聚糖的抑菌效能评价15季铵盐壳聚糖对金黄葡萄球菌的抑菌效能15季铵盐壳聚糖对大肠杆菌的杀菌效能174总结194.1论文主要结论194.2存在的问题与可持续研究的问题194.3季铵盐壳聚糖作为杀菌剂的前景展望19参考文献20致22. z.-0前言自然界中存在大量的有害微生物，不仅危害人们的安康，而且引起各种材料的分
8、解、变质和腐败，危害环境和工农业生产，带来重大经济损失1。阻止有害微生物，目前最有效的方法是依靠化学试剂，也就是杀菌剂2。杀菌剂又称杀生剂、杀菌灭藻剂、杀微生物剂等，通常是指能有效地控制或杀死水系统中的微生物细菌、真菌和藻类的化学制剂3。壳聚糖CS是一类资源丰富的天然氨基多糖，可由广泛存在于节肢动物外壳和真菌类细胞壁中提取的甲壳素经脱乙酰化制得，具有良好的生物降解性、生物相容性，且无毒副作用4，其优越的生物活性功能、良好的成膜特性和较强的抗菌防腐保鲜能力已引起国外研究人员的广泛关注和重视5。但是壳聚糖由于分子中含大量的-OH和-NH2，形成复杂的氢键作用，只能在酸性条件下使用，而且壳聚糖不溶于
9、水及大局部有机溶剂，抑菌应用场合受到了很大的限制6。季铵盐类化合物于1915年首次合成，继而发现该化合物有一定的杀菌作用7。经进一步研究说明，季铵盐的氨基能够与微生物的细胞膜发生静电吸附作用，从而可以杀灭细菌、真菌和病毒8。季铵盐化合物以其广谱高效的杀菌性能，以及使用围广、水溶性好、性质稳定、平安低毒、价格廉价等诸多优点，在自然环境、医院消毒、机械设备的外表和防生材料等方面具有非常广泛的应用9。后经实验证明，如果在壳聚糖分子上引入季铵盐侧链，就可以增加正电荷的数量，从而大大改善它的水溶性，并且具有更强的抑菌能力，对革兰氏阳性菌和阴性菌均显示出较好的抑菌效果10。在自然环境、医院消毒、机械设备的
10、外表和防生材料等方面具有非常广泛的应用。因此季铵盐壳聚糖作为一种生物杀菌剂具有广阔的应用价值11。经过研究发现，虽然季铵盐类消毒剂抑菌作用强大，但在杀菌试验中必须有效去除残留药物的干扰，才能真实地检测出其实际杀菌效果，此问题一直没有得到很好解决。随着消毒剂配方越来越复杂，残留消毒剂的去除已成为评价此类消毒剂的技术难题12。本论文拟合成一种季铵盐壳聚糖，检测季铵盐壳聚糖对不同菌种的抑菌效果，研究季铵盐壳聚糖水溶液的稳定性，验证其是否可以作为一种生物抑菌剂，同时筛选出针对季铵盐壳聚糖杀菌剂的中和剂，为产品开发奠定理论根底。1实验材料及仪器1.1实验材料与试剂季铵盐壳聚糖：由本实验室自行制备；壳聚糖
11、分析纯购于宏海生物技术；碘甲烷分析纯购于山浦化工；二甲基亚砜分析纯购于*市广成化学试剂；磷酸氢二钠分析纯购于强盛化工；盐酸分析纯购于莱阳经济技术开发区精细化工厂；蛋黄卵磷脂、营养琼脂粉、营养肉汤粉购于奥博星生物技术*公司；氢氧化钠、乙醇购于国药集团化学试剂；培养基：1液体培养基：使用营养肉汤粉和蒸馏水配制成浓度为1.9%w/v的液体培养基； 2固体培养基：使用营养琼脂粉和蒸馏水配制成浓度为3.3%w/v的固体培养基；菌株：1金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，S.aureu； 2大肠杆菌Escherichia coli，E.coli,均由本实验室提供1.2实验仪器电子天平
12、型号：AB104-N美特勒托利多公司振荡培养箱型号：HZQ-*100市东电子技术磁力搅拌器型号：RO10德国 IKA公司电热恒温培养箱型号：DHP-9052齐欣科学仪器垂直流桌上型超净工作台型号：SCW-CZ-650宏瑞净化科技集热式恒温加热磁力搅拌器型号：DF-101S省予华仪器立式压力蒸汽灭菌锅型号：GI45DS博讯实业傅立叶红外光谱仪型号：Nicolet-380美国热电集团移液器德国Eppendor公司数显酸度计奥豪斯仪器冻干机美国SIM2实验方法2.1季铵盐壳聚糖的合成15%NaOH溶液的配制：称量3g氢氧化钠，溶于17ml水中，配制成氢氧化钠溶液。准确称取2g壳聚糖粉末参加装有12m
13、l 15% NaOH溶液的平底烧瓶中，室温溶胀10min，然后参加80ml二甲基亚砜、12ml碘甲烷，60水浴加热，反响60分钟。60分钟后，再往烧瓶中参加6ml 15%的NaOH溶液和6ml碘甲烷，继续反响60min。反响完毕后，参加无水乙醇，出现白色沉淀，终止反响，透析三天，用冻干机将产品冻干，即得水溶性的季铵盐壳聚糖。2.2壳聚糖和季铵盐壳聚糖物的红外光谱表征用Nicolet-380型红外光谱仪进展分析。分别将壳聚糖和季铵盐壳聚糖与溴化钾1:5比例充分混合，压缩5分钟成片。光谱分辨率2cm-1，测量围：420-4000cm-1，扫描次数：30次。2.3季铵盐壳聚糖的抑菌性能检测采用平板涂
14、布法，以只含有菌液的PBS溶液为空白对照组，添加壳聚糖或季铵盐壳聚糖的菌液为实验组，观察作用一样时间后菌落的生长情况，检测季铵盐壳聚糖的抑菌性能13。2.3.1 培养基的配制及试剂的准备准确称取一定量的营养琼脂放置到500mL的三角瓶中，参加适量的蒸馏水，配制成浓度为3.3%w/v的固体培养基，然后放置在磁力搅拌器上搅拌溶解，搅拌速度为300rpm。用精细pH试纸测量营养肉汤的pH值。假设pH小于7.6，则在搅拌状态下，向营养肉汤中逐滴参加1moL/L NaOH溶液，用pH试纸检测pH值，直至培养基pH达7.6。反之，则用1moL/L HCL溶液进展调节，同样调节至pH达7.6为止。待完全溶解
15、后放入立式蒸汽灭菌锅中，于121C下，高温灭菌20min。灭菌后趁热倒入到培养皿中冷却，制备营养琼脂固体培养基。准确称取0.1g壳聚糖，并置于紫外灭菌台灭菌备用。准确称取0.1g季铵盐壳聚糖，并置于紫外灭菌台备用。PBS缓冲液的配制：准确称取7.9gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH2PO4(或者1.44gNa2HPO4)和1.8gK2HPO4，溶于800mL无菌蒸馏水中，使其完全溶解。用精细pH试纸测量溶液汤的pH值。假设pH小于7.4，则向PBS溶液中逐滴参加1moL/L NaOH溶液，变加变搅拌，并经常用pH试纸测定其pH值，直至培养基pH达7.4。反之，则用1moL/L HCL溶液进展调节，同样调节至pH达7.4为止。最后加蒸馏水定容至1L，所得溶液即为PBS溶液磷酸缓冲盐溶液，保存于4冰箱中即可。2.3.2菌株接种与培养用接种针接种适量的金黄葡萄球菌，浸入装有10mL无菌营养肉汤的试管中，快速震荡2min，使接种针上的细胞脱离下来均匀进入液体培养基中，静
