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1、烟用添加剂中对乙氧基苯脲的测定 高效液相色谱法实验报告云南烟草科学研究院二一二年二月九日目 录1 前言41.1 对乙氧基苯脲简介41.2 理化性质41.3 检测方法综述41.3.1 薄层色谱法41.3.2 分光光度法51.3.3 气相色谱法51.3.4 毛细管电泳法51.3.5 液相色谱法61.4 小结72 标准适用范围83 原理84 试验方法84.1 仪器84.2 试剂与材料84.3 试样前处理94.4 高效液相色谱条件104.5 标准曲线制作104.6 试样测定结果115 结果与讨论115.1 色谱条件的选择115.1.1 检测器及波长的选择125.1.2 色谱柱的选择165.1.3 流动
2、相的选择195.1.4 其它色谱条件的选择225.2 前处理步骤的选择及优化225.2.1 空白试验225.2.2 样品提取溶剂选择225.2.3 净化步骤的选择235.2.4 固相萃取条件选择及优化245.2.5 净化过程的回收率考察255.2.6 其它前处理条件的选择255.3 方法评价275.3.1 检出限和定量限275.3.2 精密度285.3.3重复性285.3.4 储备液稳定性305.3.5 试样稳定性305.3.6 试样加标回收率315.3.7 比对试验结果325.3.8 试样测定33参考文献34附件一 方法的检出限及定量限36附件二 试样中对乙氧基苯脲定性确认方法391前言1.
3、1对乙氧基苯脲简介对乙氧基苯脲（4-Ethoxyphenyl-urea），俗名甘素（dulcin），亦称甘精，是一种人工合成甜味剂，甜度大约是蔗糖的250倍，1884年被Joseph Berlinerbau发现。由于其与糖精钠相比没有后苦味，7年以后作为人工合成甜味剂进行大批量生产，在20世纪初占有很大的市场，作为糖尿病患者的代糖。1951年美国FDA对对乙氧基苯脲的安全性提出了质疑，1954年经过多次的动物实验证明了其能够水解成氨基苯酚而引发肿瘤，从而退出市场。对乙氧基苯脲在人体中的吸入、分布、代谢及排泄目前并无资料。经动物实验(兔与大鼠)结果显示：三小时內快速吸收进入血液，但排泄粪便中没有
4、发现代谢物，除了脂肪之外的大部分组织中对乙氧基苯脲代谢消失都很慢。联合国粮农组织与世界卫生组织（FAO/WHO）建议每日容许摄取量：禁止使用。世界上大部分国家（美国、日本、中国台湾、中国香港）均禁止食品中使用对乙氧基苯脲。有研究表明，成人摄入20-40 g会头晕、恶心，并可能导致低血压与发绀和高铁血红蛋白血症。在我国，对乙氧基苯脲不在卫生标准GB2760允许使用的甜味剂名单范围内。据文献报道1，常在蜜饯食品中检验出对乙氧基苯脲的存在。1.2 理化性质对乙氧基苯脲是酰胺类物质，也是脲中的一类。化学式为C9H12N2O2，CAS号为：150-69-6。对乙氧基苯脲是具有金属光泽的白色针状晶体，分子
5、量为180.212，熔点：173-174 ，在水中的溶解度为3.8 g/L3。可由对乙氧基苯胺盐酸盐和尿素加热反应制得，或者将对氨基苯乙醚与二氯化碳作用后，再加入氨气而制成4。对乙氧基苯脲的分子结构式如下图：对乙氧基苯脲分子结构式1.3 检测方法综述目前能够检索到的检测方法主要包括：薄层色谱法、分光光度法、气相色谱法、毛细管电泳法、液相色谱法，下面就对乙氧基苯脲检测技术发展情况分类介绍如下。1.3.1 薄层色谱法Kamp.W.等9在1966年用薄层色谱技术分离并鉴定了对乙氧基苯脲、甜蜜素和糖精钠。1972年Ryuzo Takeshita10利用薄层色谱法检测食品中的甜味剂(糖精钠、甜蜜素和对乙
6、氧基苯脲)，先用乙酸乙酯提取，硅胶和中性氧化铝柱净化，再经过聚酰胺色谱板分离，方法灵敏度范围0.012g。1.3.2分光光度法1.3.2.1荧光分光光度法文献报道关于对乙氧基苯脲荧光分光光度检测方法，该类方法是基于增强对乙氧基苯脲荧光强度展开的一系列工作。Uchiyama S11于1969年首次提出了用亚硝酸钠与对乙氧基苯脲作用，再用荧光分光光度法检测食物中的对乙氧基苯脲。Sadao Uchiyama12在1972年报道了用荧光分光光度法测定对乙氧基苯脲与亚硝酸钠反应得到的产物，该方法是在室温条件下，经过对乙氧基苯脲与亚硝酸钠和盐酸发生化学反应，混合的反应产物与氢氧化钠反应这两个步骤后，用氯仿
7、提取、硅胶柱分离纯化，采用荧光分光光度计检测样品中的对乙氧基苯脲。Sadao Uchiyama131977年具体介绍对乙氧基苯脲与亚硝酸钠的反应条件，如反应的温度，时间。还提出反应得到的产物的荧光性是对乙氧基苯脲的5倍，明显增强了对乙氧基苯脲的荧光性，检出限也比之前降低了20倍，用此方法测定苯胺类物质的衍生物，尤其是对位的苯胺类物质、氨基苯乙醚时，可以提高方法灵敏度。1.3.2.2紫外可见分光光度法1983年，M.Veerabhadra Rao等14将对乙氧基苯脲在6.0 mol NaOH条件下进行水解，水解以后的对乙氧基苯脲在pH=3.0条件下被次氯酸钾氧化，然后在pH=10.0的条件下，与
8、酚的作用下得到靛酚，该衍生物吸收波长为630 nm，方法测定的浓度范围为0.5-8.0 g/mL，回收率达到99.5-100%。2000年，美国AOAC 17th 出台了官方方法957.11规定了食品中对乙氧基苯脲的测定方法，方法分为快速显色定性方法和紫外分光光度比色定量方法6，7两个部分。其中分光光度法定量检测的对象是非酒精饮料，通过溶剂萃取纯化样品，分光光度计定量测定，检测波长为294nm。1.3.3 气相色谱法1971年H.Konig15采用气相色谱同时检测糖精、甜蜜素、对乙氧基苯脲。其中糖精和甜蜜素用重氮甲烷来进行衍生，其中对乙氧基苯脲则不需要衍生化处理，三种物质检出限达到分别为0.2
9、,0.02和0.02g/mL。另据报道测定食品中的对乙氧基苯脲的前处理步骤包括：先用水萃取样品，1N硫酸使之酸化，正己烷除去样品中的脂肪，之后将水萃取液的pH调至11-13，再用乙醚萃取浓缩至干，并用98%乙腈溶解后进行气相色谱测定。就气相色谱测定对乙氧基苯脲的方法而言，前处理步骤繁琐，操作复杂、耗时。 1.3.4 毛细管电泳法根据对乙氧基苯脲易离子化的特点16，该物质也适用于毛细管电泳检测技术。针对样品疏水性质的差异，采用胶束电动毛细管色谱(MECC)直接将其分离和检测。1995年，Catherine O.Thompson17用胶束电动毛细管电泳法测定低热量饮料中的几种甜味剂（阿斯巴甜，糖精
10、钠，安赛蜜，阿力甜和对乙氧基苯脲），用开管毛细管柱，0.05 M脱氧胆酸钠、0.01 M磷酸氢二钾、0.01 M硼酸钠作为缓冲盐（pH=8.60），方法回收率为104-112%，精密度达到0.63-2.6%。2000年，Lin YH18用毛细管柱,在 0.05 M脱氧胆酸钠、0.02 M硼酸(pH 8.6)、5%乙腈组成的缓冲溶液中，选取20 kv分离电压和214 nm检测波长条件下，采用胶束电动毛细管电泳来同时分离和检测蜜饯中对乙氧基苯脲、阿斯巴甜、糖精、安赛蜜和9种防腐剂（山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸钠、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和异丁基对羟基苯甲酸），方法平均回收率达到90%，检出限范围
11、为10-25g/g。1.3.5 液相色谱法近年来随着液相色谱的普及和相关技术的发展，使得液相色谱在食品检测领域内得到了迅速的发展，在检索到的文献中，关于对乙氧基苯脲的液相色谱方法均采用反相高效液相色谱来检测对乙氧基苯脲，前处理方法由液-液萃取或固相萃取技术组成。1.3.5.1 液相色谱紫外检测法1999年，Kobayashi chigusa8等建立了五种甜味剂的液相色谱检测方法，该方法将制备后样品与0.01 mol/L的盐酸含10氯化钠溶液反应，经过盐酸透析、C18固相萃取柱分离后，采用甲醇：水=45：55的流动相，完成样品中五种甜味剂（阿力甜、安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜和对乙氧基苯脲）的检测。
12、杨雪娇1等用高效液相色谱法测定蜜饯中的对乙氧基苯脲，用SB-C18色谱柱(4.6 mm150 mm,5 m)作固定相，以磷酸二氢钾溶液-乙腈(60+40)为流动相，在240 nm波长条件下用二极管阵列检测器或紫外检测器进行检测。结果显示：线性范围1.0-200.0 g/mL，方法的测定下限(S/N=3)为0.2 g/mL，加标回收率88.3%-94.0%，相对标准偏差0.0772-2.65。该方法的前处理步骤为：蜜饯样品去核、粉碎均匀后，称取5-10 g置于100 mL容量瓶中，加水溶解后，缓慢加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各5 mL除蛋白质，用水定容至刻度，取上清液磁力搅拌30 min后，用
13、干燥滤纸过滤，滤液用0.45 m微孔滤膜过滤。B. H. Chen19在1995年对多种甜味剂（对乙氧基苯脲、糖精钠、安赛蜜），防腐剂（脱氢乙酸钠、山梨酸、水杨酸、苯甲酸、琥珀酸等）和抗氧化剂（3 -叔丁基-4羟基和第三丁基对苯二酚），a-羟基异丁酸和乙腈（2.2:3.4 或2.4:3.6）和溴化十六烷基三甲基铵与被测物质形成离子对作为流动相，选用C18柱，紫外吸收在233 nm,检测限范围：0.15-3.00 g。M.Veerabhadrarao20等人以BondspakC18为分离柱，甲醇，乙酸，水混合体系（20+5+75）为流动相，检测波长在254 nm可测定咖啡因、对乙氧基苯脲、苯甲酸
14、和香兰素。如将流动相换为甲醇、乙酸和水的混合体系（35+5+60），可检测阿斯巴甜。误差百分率及相对误差百分率为：0.3-2.8%，1.64-3.60%。回收率达到91.6-101.8%。P.W.Wu21探讨以高效液相色谱分析饮料中的糖精,安赛蜜,阿斯巴甜和对乙氧基苯脲饮料经过ODS-4净化器净化以后,使用BondapakC18（3.9 mm300 mm,10 m）为分析柱，以磷酸调节pH=6.0，浓度34 mM的TEA-OH，紫外吸收波长在210 nm,经过30分钟可以同时检出4种甜味剂，回收率92.2%以上。1.3.5.2 液相色谱蒸发光散射检测法蒸发光散射检测器是一种通用型检测器，其最突
15、出的特点是可以对没有紫外、荧光吸收的物质进行检测，使用该检测器可以不依赖于物质的特征。2007年Andrzej Wasik22用高效液相-蒸发光散射检测器法测定饮料中的9种甜味剂（安赛蜜，甜蜜素，阿力甜，纽糖，对乙氧基苯脲等）,方法检出限15 g/g,定量限30 g/g,加标回收率达到93-109%，精密度4.0%，线性范围在25-150 g/g之间。该方法的前处理步骤包括：取5克均质样品至50 mL容量瓶，用pH4.5的缓冲溶液（甲酸-三乙胺）溶解稀释至刻度，振荡超声15分钟，然后以10分钟4000转的转速离心。SPE柱先用3 mL甲醇与32 mL缓冲液先活化，SPE柱的柱流速为1-2 mL/min,取离心后的上清液10 mL上至SPE柱床，用3 mL缓冲液冲洗杂质，22 mL甲醇进行洗脱柱上的样品。2009年英国颁布了测定食品中9种甜味剂的检测标准23(标准号：09/30197132 DC)
