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1、实验五 激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定a-淀粉酶活力的方法。二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反 应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合 物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉 酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些
2、物质在低浓度时为某种酶的激活剂， 而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约 30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反应的影响 是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使 酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其 变化趋势呈钟形曲线变化。食品级a-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽抱杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生 物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的
3、最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。 a-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的a-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短 链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称a-淀粉酶 为液化淀粉酶。a-淀粉酶不能水解淀粉支链的a-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和a-1,6键的寡糖。本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单 位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪a-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。三、
4、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响（一）试剂及材料1、1： 30唾液淀粉酶配置 用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1： 30倍蒸馏水稀释。2、0.2%可溶性淀粉3、1%NaCl 溶液4、1%CuS04 溶液5、标准稀碘液吸取（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。三）操作方法取试管3 根，编号后按下表配置实验样液。试管序号0.2%可溶性淀粉1%NaCl1%CuS04蒸馏水混匀，放入37 C水浴中 保温10min。立即加入唾液淀粉酶。1： 30唾液淀粉酶不显蓝色所需时间12.0 mL1.0 mL/1.0 mL230 min22.0 mL/1.0 mL/1.0 mL超过15 min32.0 mL/1.
5、0 mL1.0 mL439min用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内 样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。四、温度与PH值对a-液化淀粉酶活力的影响（一）试剂与材料1、 2%可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉2.0g （预先在105C烘干），预加20mL蒸馏水调匀，然后倾入80mL沸水中 煮沸至溶液透明，冷却后定容至100mL。2、PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（1）0.2 mol /mL Na2HPO4 称取 35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至 100mL。（2）使
6、用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。3、 供试酶液的制备 称取固体a-液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液100mL （缓冲液的加 入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在5-10min内完成），于40C恒温水浴中活化0.5小时，然后用3000rpm / min离 心机离心分离5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。4、标准比色液甲液：称取氯化钻（CoC1.6H2O） 40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748 g,溶解并定容至500mL。乙液：称取铬黑T 40.00mg，溶解并定容至100mL。使用时取甲液40.0mL、乙液5.0 mL,混合。混合比色液宜放置冰箱保存
7、，使用7天后重新配置。5、标准稀碘液。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三）操作方法1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。2、不同温度对a-液化淀粉酶活力的影响取4根25x200mm试管，按下表配制反应溶液。试管序号12342%可溶性淀粉20.0mL20.0mL20.0mL20.0mLPH6.0缓冲液5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL把四根试管分别放入50C、60C、70C、80C恒温水浴中预热10min分别加供试酶液0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL反应完成时间记50 C60 C70 C80 C录（min）537503超过15超过15加
8、入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2 滴反应液，滴入预先 盛有2/3 稀碘液的比色白瓷板孔穴内 ，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内 颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。3、不同PH值对a-液化淀粉酶活力的影响取5根25x200mm试管，按下表配制反应溶液。试管序号2%可溶性淀粉缓冲溶液恒温水供试酶液反应完成时间记录（min）120mLPH4.05.0 mL0.5 mL246320mLPH6.05.0 mL浴60 C0.5 mL353420mLPH7.
9、05.0 mL预热0.5 mL610520mLPH8.05.0 mL10min。0.5 mL651其它操作与温度对酶活力影响实验相同。五、结果计算和讨论淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下， 1 g 酶制剂 1小时内液化可溶性淀粉的克数酶活力单位（U/gf60 x 20 x 0.02 x養x n（1酶制剂稀释倍数，取200）t0.5式中：20可溶性淀粉的用量（mL）；t酶解反应完成所需的时间（m in）；0.5-测定时稀释酶液用量（mL）；0.02可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL）；1、不同温度对a-液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果50 C60 C70 C80 C酶活力(U/g)8949543
10、20320PH 值酶活力单位。实验结果pH4.0pH6.0pH7.0pH8.0酶活力(U/g)195113597867372、不同pH值对a液化淀粉酶活力影响的结果记录讨论分析实验结果。由第一个实验可验证激活剂与抑制剂对反应速度的影响，其中的常见的激活离子:无机阳离子，如钠离子、钾离子、等； 无机阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子等；实验试剂取NaCI溶液与淀粉酶反应，可见反应速率是最快的，因为当 中的钠离子与氯离子都可促反应的发生。导致溶液不显蓝。对于抑制剂对酶促反应速度的影响，是可以减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂。它可降低酶促反应速 度。可见CuS04的不显色时间已经超过15分
11、钟，酶己娙失效。结论为低浓度的CuS04是抑制剂，低浓度的NaCI是 激活剂。第二个实验，影响酶促反应速度的因素：S、E、pH、温度、激活剂与抑制剂，过酸过碱都能使酶蛋白变性而使其丧 失活性。在不致使变性的 pH 值范围内，酶的活性会因 pH 值不同而不同。每种酶均有各自的最适温度和最适 pH 值， 如符合这最适条件，酶的活性便最高。相反，偏离这最适条件，酶变的不活跃。由温度酶活力单位图可见，最适温 度为在60C,低于适当的温度会使酵素失去活性，但是升高温度后可以恢复酵素活性。当温度达至16080C时，大部 分酶被破坏，发生不可逆变性；由 PH 值酶活力单位可见，淀粉酶在 pH4 中具有最好活
12、性， 酶在最适 pH 范围内表 现出活性，大于或小于最适pH,都会降低酶活性。并由图可见，到了pH7,8中性时已经较pH4时活性下降了不少，由 此可判断淀粉酶在微酸性时活性高。但正常的酶的变化趋势呈钟形曲线变化，而人体的消化酶ph值大概在68，微酸 和微碱，可推断这次实验的结果有误差，可推测是人为计时有问题，因为溶液的调配没有问题。，我们应该从放下酶的 时候开始计数，估计误差出在溶液滴入比色皿才开始计时，导致显色时间缩短，导致误差。六、思考题1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？要注意的是，时间的计时方面，因为溶液众多，许多同学为了加快完成实验，导致计时失误，因为这次计酶的活
13、 性就体验在显色的时间，时间是关键。两个人的配合很重要，分工要明确，不然会导致不停重做。另外需在下酶就开 始计时，并隔一会就滴另一个格，观察显色。记好格是属于那个溶液，不要贪快同时做几支试液，很易搞混。在温度 对酶的影响时，因为为了方便，同枱的四个炉一齐运作，每个炉有不同温度，又因炉的功能简单，需要留意着温度计， 因为如果不留神就会令烧杯升温或降温，影响酶的活性。在计pH值对酶影响时，因为四支溶液共浴在一个60度的烧 杯中，建议在试管做好标记，虽然结果会呈钟形，可推判出那个支的pH值，但会影响实验的准确度。4、用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？1可以确定酶是否可用2使用酶的时候提供参考，以便明确具体要使用多少酶用于底物的催化。
