《人椎间盘细胞髓核原代培养及细胞计数》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人椎间盘细胞髓核原代培养及细胞计数（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、人退变椎间盘髓核细胞的分离及培养1. 取髓核摘除手术切除的标本，置入预先准备好的内含少量 DMEMF12 培养液 的无菌培养瓶并置入冰盒内迅速带回实验室。2. 半小时内在超净台内，于烧杯内剪碎消化培养。3. 将取出的髓核组织用 PBS 液冲洗 3 次去除血污，弃去纤维环。4. 将胶冻样或软骨样髓核组织剪碎成 1mm3 大小的碎块。5.37C下以0.25%（m/v）的胰蛋白酶消化20min,每5min,轻轻摇动1次800r/min 离心5min,弃去上清液。6.37C下用0.2%的II型胶原酶静置消化4h,至组织块逐渐消失。800r/min离心 5mi n,去除上清液。7. 用DMEM/F12培
2、养液吹匀细胞，再次离心，重复3次。8. 用计数板进行细胞计数,按 1*106/ml 接种于底面积为 25cm2 培养瓶中,加入 5ml含青霉素100U/ml、链霉素100U/ ml和20%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培 养液。37C、体积分数为5%C02的培养箱中培养。9. 每23d换液1次，未较好融合前半量换液，每2d用倒置相差显微镜进行观 察、拍照。10.90%融合后用质量分数为0.25%的胰酶消化后1:2传代。 转染使用第二代的髓核细胞,可培养至第四代。细胞计数：实验用品：0.4%台盼蓝溶液、无水乙醇或95%乙醇溶液、脱脂棉普通显微镜、试管、吸管、毛细吸管、细胞计数板、绸布。实验
3、内容与方法：（一）制备动物细胞悬液将动物细胞用生物盐水制备成适当浓度的细胞悬液备用。（二）细胞计数1. 计数板处理用无水乙醇或95%乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把 盖片覆在计数板上面。2. 染色用滴管吸取0.4%台盼蓝染液，按1 : 1比例加入细胞悬液中。从计数板边缘缓缓 滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中 或带有气泡，否则要重做。稍候片刻，将计数板放在低倍镜下（10x10倍）观察 计数。3. 计数方法按图计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计 数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。
4、在一个大 方格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计 右线细胞。二次重复计数误差不应超过5% （图7-1）。镜下观察，凡折光性强而 不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。4. 计数的换算计完数后，需换算出每ml悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为0.01 cm2,高为0.01 cm,这样它的体积为0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1 ml = 1000 mm3,所以每一大方格内细胞数x10 000 =细胞数/ml，故可按下式计算：细胞悬液细胞数/ml = 4个大格细胞总数/4x10 000如计数前已稀释，可再乘稀释倍数。计数细胞后，计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。注意事项：向计数板中滴细胞悬液时要干净利落，加量要适当，过多易使盖片漂移，或淹过 盖片则失败，需重做，过少易出现气泡；不理想时，应重做；镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将 细胞悬液进行混合，再重新计数。
