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1、PCR常见问题分析与对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品那么无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不适宜 3.引物设计不当或者发生降解 4.反响条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物防止链间二聚体和链二级结构或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏
2、高 5.退火温度偏低 6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不适宜 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物 的
3、交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪或溅出离心管外； 2.除酶与不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 与加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进展分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规那么甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反响的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量与， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进展分析研究。 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丧失过
4、多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电
5、泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止屡次冻融 或长期放冰箱冷藏局部，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低那么影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反响体积的改变：通常进展PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多
6、 大体积进展PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否那么容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 假阳性 出现的PCR扩增条带与
7、目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不适宜：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进展PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的穿插污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪或溅出离心管外。除酶与不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管与样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本 前，反响管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这
8、些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，与PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 那么不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板
9、量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 克隆PCR产物的最优条件是什么？ 最正确插入片段：载体比需实验确定。1：1插入片段：载体常为最正确比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片
10、段共10ul。室温保温1小时，或4oC过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。 PCR产物是否需要用凝胶纯化？ 如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？ A涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，说明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。 B转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率
11、。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反响所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X103次方 ng /铺板1 ng DNA ug=106次方cfu/ ug转化pGEM-T应用108次方cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。 C如用pGEM-T正对照，或PCR
12、产物，产生20-40蓝斑用指定步骤108次方cfu/ ug感受态细胞，说明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶M1801，M1804，M1794质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。 D用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞108次方cfu/ug,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。 对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？ A连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。 B插入片段带
13、有污染，使3-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3-T缺失。 C插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。 D带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料TM042。 E高
14、度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行： 将PCR反响的试管与反响板紧贴。 当酶反响混合物以70“热启动开场循环时，切记在参加酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。 不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。 对于有问题的PCR反响，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进展预变性，后加模板进展正常PCR扩增。 没有扩增产物： 在提供MgCl2缓冲液中，以0.25m
15、mol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。 泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，那么按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反响中可能缺少游离的Mg2+。 检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。 检查模板和引物的用量。 增加循环次数和/或模板DNA的用量。 泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板DNA的用量。 提高退火温度，但不要超过68。 重新设计引物或设计更长的引物。 其他值得注意的条件： 建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92时不能有效地使模板变性。 最正确反响体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖对盖子加热的PCR仪可以不加。 大多数反响中，0.75ml0.51ml的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。 建议使用1.75mmol/L MgCl2350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2500mmol/L
