单链丝状噬菌体载体

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1、第四节单链丝状噬菌体载体一、M13噬菌体的生物学1. M13噬菌体的组成和结构M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞， 而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13噬菌体的基因组为单链DNA，由6407的碱基组成（GenBank注册号为 V00604）。基因组90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因，基因 之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因W和基因I以及基因II 和基因W之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。M13噬菌体基因组可编码3类蛋白质，包括复制蛋白（基因II，V和X）， 形态发生蛋白（基因I，W和XI），

2、结构蛋白（基因I、丑、W、W和X）。 所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组DNA为正链， 按基因II至基因W方向合成，与噬菌体的mRNA序列同义。图3-20是M13 噬菌体的遗传图谱。图3-21： ML3噬菌体的遗传图谱 图21= M13箜菌榭粒结构倒1M13噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长880nm ,直径6-7nm。噬菌体颗粒的核 心由2700个基因W编码的结构蛋白呈管状排列而成（图5-32），成熟的基 因W的产物为由50个氨基酸残基组成的a螺旋蛋白。顶端由5个基因W 和5个基因IX产物组成，作用于间隔区中的包装信号。5个基因III蛋白和 5个基因丑 蛋白位于丝杆的末端

3、，参与对性纤毛的吸咐。图3-21是M13噬 菌体结构模型。2. M13噬菌体的增殖吸附是噬菌体感染的第一步，M13噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带F质 粒的菌株可产生性纤毛。在吸附过程中，噬菌体的基因III蛋白与性纤毛发生作 用。随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因III蛋白与宿主的TolQ、TolR和TolA 蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒DNA及附着于其上的基因I蛋白进 入宿主菌体内。,Eg*叫 sHng-slFandMl circular DNA is convertad lo dOLHya-slrandMl nep lie alt ng lcwmAf| &NA by Iwat- a

4、riGoded enrymea .Several r oon ds ni repiicslion occur I hrcMflh N sl ruclkMes.Tha (T strand of lhe RF DMA b lw senbed into vir-al mH NAsThe 炳W期I g娜* II 具rWuc-inimHuc屈&片 FIfCR 削 由山此虹I is rnd Mraw) an thi9 (*) slrand of RF ElJAProgeny (*) Btrand rB syrtli&siz&d tinuausly 坷 酣口炉tmoni of 瞄 rpiicatiCMi m

5、iichiiwry JirouiMi the (-5 9-Uand Iran in g circle repiicalj&n：i.Tho- compleCeciprogeny 4* I slrsnd is cJeaved from the rolling circular Hrueiure by iho viral gmne II product |ned arrnw. The proQeny slrand ln oinsufaci 莘瓦Synlbego. proQny (+) strand emtinues.图3-22= ML3噬菌傩在感染细胞中的复制在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA

6、(正链)在宿主酶的作用下转变成环 状双链DNA，用于DNA的复制，因此这种双链DNA称为复制型DNA(replicative form DNA)，即 RF DNA。通过。复制方式，RF DNA 进行 扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转 录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子 的基因转录更频繁。M13噬菌体在感染细胞中的复制见图3-22。当基因II蛋白在亲代RF DNA的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌 体基因组进行滚环复制。此时，在大肠杆菌的DNA聚合酶I的作用下，以负 链为模板在切口的3末端加入核苷酸，并持续DNA的

7、合成，用新合成的DNA 替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代的正链由基因II产物 切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组DNA。在感染开始的1520分 钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成RF DNA，然后以之为模 板继续转录并继续合成子代正链DNA。当感染细胞内累计有100-200个RF DNA时，细胞内也产生了足够的单链DNA结合蛋白，即基因V蛋白。该蛋白 可以抑制翻译活性，特别是抑制基因II mRNA的翻译，并且强烈地结合在新合 成的正链DNA上，阻止其转化成RF DNA。此时，DNA的合成几乎只产生子代 正链DNA。另外，基因X蛋白和基因V蛋白也是噬菌体特异

8、DNA合成的强 力抑制子，从而限制感染细胞内RF DNA的数量。结果，感染细胞内RF DNA的 数目和子代正链DNA的产生速率都能保持适度。成熟噬菌体颗粒由11个病毒蛋白中的5个组成，至少4个其他蛋白(如基因 I、W和XI蛋白，以及宿主的硫氧还蛋白(thioredoxin)对噬菌体颗粒的 组装和分泌是必须的。二、M13噬菌体载体单链DNA的酶切和连接是比较困难的，因此M13噬菌体在用作载体时是利用其 双链状态的RFDNA。RF DNA很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进 行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。1. 载体的插入位点在M13噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可

9、用来插入外源 DNA（基因II/W和基因 W/m 之间）。基因II和基因 W 之间的508bp间 隔区是主要的外源片段插入位点。在基因w和基因m之间的小间隔区也可用 来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选， 比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因X也可用来克隆外源片段。2. M13噬菌体载体组成现在所使用的M13噬菌体载体是Messing及其同事建立的mp系列载体，以基 因II和基因W之间的区域作为外源DNA插入区。mp载体系列都是从同一个重组M13噬菌体（M13mpl）改造而来的。在M13mpl 载体中，间隔区内的Haem位点插入了一小段大肠杆菌DNA，引入a互

10、补筛 选。3. M13mpl8 和 M13mpl9M13mpl8和M13mpl9这两个载体含有13个不同的酶切位点，可供插入由多种 各不相同的限制酶切割而成的DNA片段（图3-23）。M13mpl8和M13mpl9 DNA 的全序列已经测定完成（GenBank注册号为M77815和L08821），这两种载 体只是在lacZ区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。图3-23= M13iigil8/19的途传图谱当RF DNA被两种不同的限制酶切割以后，M13mpl8和M13mpl9轻易不能重新 环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链DNA片段时，方可闭合成 环。这一片段在M13mpl8和M

11、13mpl9中将以两个互为相反的方向插入。这样一 来，在M13mpl8的正链中含有外源DNA双链的其中一条链，而在M13mpl9正 链中则含有外源DNA的另一条链，即M13mpl8重组体的子代噬菌体内含有外源 DNA的一条链，M13mpl9重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。故用 M13mpl8和M13mpl9作为一对载体，就可能用一个引物(通用引物)，从所 插入DNA片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的DNA序列，并可制备只 与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。三、M13噬菌体载体的宿主菌由于M13噬菌体通过F质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌 来增殖病毒。Mess

12、ing及其同事已经构建了许多携带F质粒并便于M13载体 进行基因操作的多种大肠杆菌菌株，其中最重要的遗传标志有：(1) lacZ D Ml5 lacZ基因缺失突变体。(2) D(lac-proAB)lac基因缺失突变体。(3) lacIq lacI基因的突变体。(4) proAB细菌染色体上脯氨酸生物合成酶类的编码区域。(5) traD36抑制F因子接合转移的突变。(6) hsdRl7与hsdR 4对大肠杆菌K株I类限制-修饰系统失去限制活 性但仍保留修饰功能的突变体。(7) recA1大肠杆菌重组酶基因。(8) supE琥珀抑制基因。在M13噬菌体载体中进行克隆时常用的宿主菌株如下。JM10

13、1 supE D (lac-proAB) FtraD 36 proAB + lac I q lacZ D M15JM105 JM101/ hsdR 4JM107 JM101/ hsdR 17JM109 JM101/ hsdR 17 recA1TG1 JM101/ hsd D5 (不修饰不限制)XL1-Blue supE lac-hsdR 17 recA1 F proAB + lac I q lacZDM15Tn 10 (Tet r)四、丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题在丝状噬菌体载体的克隆中经常遇到两类问题。(1) 外源DNA区段的部分缺失(2) 外源DNA总是以单方向插入五、噬菌粒噬菌粒(

14、phagemid)实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和 丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素抗性选择 标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。此间隔区含噬菌体DNA合成的起始 与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列。含噬菌粒的细菌被噬 菌体感染后，基因II蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产生ssDNA 并进行包装。克隆于这些载体内的外源DNA区段可以象质粒一样用常规方法进行增殖。而带 有这种质粒的细菌被M13 (或f1)丝状噬菌体感染后，在病毒的基因II蛋白 影响下，质粒的复制方式发生改变。基因II产物与质粒所携带的基因间隔区相 互

15、作用，启动滚环复制，产生质粒DNA 一条链的拷贝，最终包装在子代噬菌体 颗粒中。PUC118和pUC119是功能比较完善的噬菌粒载体，对外源DNA片段的大小不那 么敏感，并且保留了 pUC质粒在克隆操作方面的优点（图3-24）。在pUC18/19 中增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所 必需的顺式序列（IG），当含这些质粒的细胞被适当的M13丝状噬菌体感染时， 可合成质粒DNA的其中一条链，并包装在子代噬菌体颗粒中。通过纯化噬菌体 颗粒，可制备单链DNA，用于DNA序列测定、定点诱变或制备探针。噬菌粒具有以下特征： 双链DNA既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；

16、 免却了将外源DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步 骤； 由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。噬菌粒的主 要优点在于它可以产生大段外源DNA的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突 变，而这些外源DNA区段常常由于太大而不能克隆于常规M13载体。但许多噬 菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链DNA的产量较低且 重复性较差。六、M13KO7辅助噬菌体M13KO7辅助噬菌体是M13的衍生株，大小为8.7kb，其结构组成见下图。M13KO7噬菌体带有来自p15A质粒的复制起点，因此可以象质粒一样复制，且 可以与带ColE1的质粒共存于同一个宿主菌中。还带有一个来自转座子Tn903 的卡那霉素