无菌检查方法的验证

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1、无菌检查措施的验证 无菌检查措施是为了检查药典规定无菌的制剂及其她制品与否无菌而建立的实验措施，是作为无菌产品批放行的重要根据及药监部门对无菌产品质量监管的一种重要项目。因此如何保证无菌检查措施的精确可靠至关重要，而检查措施的验证是保证检查成果的公正、科学和精确的基本，因此各个重要国家的GMP或药典都对无菌检查措施的验证提出了严格的规定,中国药典对分析措施验证和检查的规定也有大幅度的提高，同步也是GM检查中检查的重点和容易发现问题的区域。 验证规定与措施 无菌检查措施验证一般分为前验证和再验证两种。 前验证,也称预验证,指在无菌分析措施正式使用前,按照预定验证方案进行的验证。如果没有充足的理由

2、,任何检查措施必须进行前验证。 再验证,指某一检查措施通过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证明已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查措施进行修订、变化时进行的验证。 一般一种无菌产品的检查流程为：一方面基于产品的剂型、溶解度等性质,按照药典的规定拟定与否需要进行前解决;然后根据产品的特性与否有抑菌性，拟定与否需要增长清除产品抑菌性的措施；最后验证整个检查措施中用到的一切及实验过程中的每一种环节涉及样品的预解决方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。 这里,验证的重点环节涉及: 前解决措施直接影响后续环节的效果和重现性，应是验证的重点。 供试品中抑菌活性的清除是目前验证工

3、作的重点,特别强调应充足验证供试品自身对微生物生长的影响。具体的验证措施如下： 菌种的选择 无菌检查措施验证中一般选择如下6种实验中常用的控制菌的原则菌株,它们分别代表不同类型的菌种:枯草芽孢杆菌MCC(B)6 50代表药物中常用的污染菌芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26 03代表革兰阳性菌、生孢梭菌 CMCC()64 94代表厌氧菌、大肠埃希菌 MC(B）44 10代表革兰阴性菌、白色念珠菌 CCC(F）9801代表酵母菌、黑曲霉菌 CMC(F)8 3代表霉菌。 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的

4、新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035 培养182h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，232培养2448,上述培养物用.无菌氯化钠溶液制成每1m含菌数不不小于100fu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,228培养5天，加入5m含.05%(ml/m）聚山梨酯的.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后，采用合适的措施吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.0%(m/l)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数不不小于10cfu的孢子悬液。样品的前解决 无菌产品中每个成分应当是均匀的,因此只要拟定在验证的措施中,按所需的总接

5、种量即可，而不必像样品平常检测中按规定的容器数取样。 如果制备样品时需要使用溶解剂、稀释剂、助溶剂、破乳剂等溶剂，需要保证这些溶剂是有效的,并且其使用对微生物生长无影响;或者制备过程中需要对样品进行加热助溶、离心等操作时，需要保证加热的温度、离心速度和离心时间等对微生物生长或分布无影响。 不需前解决的样品免做。消除样品抑菌性的措施 无抑菌性样品的验证措施:根据产品溶解性和微生物限度选择合适的中性稀释剂溶解和稀释，用直接接种法验证,常用中性稀释液或淋洗液。 对于具有抑菌性样品的验证措施,一方面拟定样品的抑菌作用(抑细菌、真菌实验验证)，选择敏感原则菌株对供试品抑菌活性清除效果检查（阳性菌回收实验

6、）。常用的消除样品抑菌活性的措施如下:稀释法:运用减少供试品的相对浓度，将样品稀释至最低抑菌浓度下进行。如：取规定量的样品溶液至较大量的培养基中，使单位体积内的样品含量减少,至不含抑菌作用。 薄膜过滤法:运用体积差别分离,通过薄膜过滤,微生物被截于滤膜，培养薄膜观测有无微生物生长。一般薄膜孔径应不不小于05m，直径一般为50?m,若采用其她直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调节。滤器和滤膜在使用前采用合适的措施进行灭菌。使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试液其滤膜和滤器在使用前应充足干燥。 供试液通过滤膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张

7、滤膜每次冲洗量为100？ml。总冲洗量不得超过000l。 化学中和法:运用化学(生物）专属性灭活，常用中和剂或灭活措施有：对氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯80等。对化学中和剂不敏感的样品,用酶中和,如内酰胺酶。联合使用：将以上两种或几种措施组合运用，以消除样品的抑菌性。合用于抑菌作用较强的中西药制剂。另一方面按照如下规定制备3组样品: 样品组:选择以上合适的措施中和样品,加入少量验证微生物(接种量少于100？cu）。 对照组：01%蛋白胨或pH70无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,加少量微生物(接种量少于0?cfu)。 阳性对照组：将实验菌株直接接种于培养基中(接种量少于10c)。 最后成果分析如下：样

8、品组与对照组微生物生长数量相似，表白中和剂的中和方式有效消除了样品的抑菌性(即有效性)，如果对照组与阳性对照组的微生物数量相似，表白样品预解决、消除样品抑菌性的措施、检测程序和培养条件等均不影响微生物生长(即无毒性)。样品如无抑菌性，省去对照组实验,样品组与阳性对照组直接比较。样品组微生物生长数量不及阳性对照组微生物生长数量,表白样品的预解决、实验用器具材料、培养条件等方面存在对微生物生长不利的因素。 为考察验证措施的稳定性和重现性，验证至少需3个不同批次的同类样品,分别进行3次验证明验。 无菌检查措施验证明验设计 薄膜过滤法：按照药典的规定取每种培养基规定接种的样品总量按薄膜过滤法过滤、冲洗

9、，在最后一次的冲洗液中加入不不小于00c的实验菌,过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养或改良马丁培养基中,或将培养基加至滤桶内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量实验菌，作为对照。按照药典的规定的温度和时间进行培养。 直接接种法：取符合直接接种法培养基用量规定的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入不不小于100fu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管;取符合直接接种法培养基用量规定的改良马丁培养基管，分别接入不不小于10?c的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中管接入每支培养基规定的供试品接种量，另管作为对照,按照药典的规定的温度和时间进行培养。 成果判断 同对照管比较，如

10、含供试品各容器中的实验菌均生长良好，则阐明验证通过;如含供试品的任一容器中的实验菌生长单薄、缓慢或不生长，验证失败,应采用增长冲洗量、增长培养基的用量、使用中和剂和灭活剂、更换滤膜等措施，消除供试品的抑菌作用,重新进行验证。新GP检查重点一方面要检查措施验证方案设计的科学性和完整性,与否有与药典措施相悖的地方,特别是产品自身的抑菌性，检查措施的选择，是直接接种法还是薄膜过滤法等。 无菌检查措施验证的硬件与否具有及与否已经进行了有关的确认。如使用黑曲霉菌与否具有生物安全柜并进行确认,无菌室的确认及平常监测，培养箱的型号及数量和进行确认的状况等，智能集菌器、全封闭无菌实验过滤培养器的型号、性能,滤

11、膜与否符合规定等。 验证中各个环节有关数据的真实性，如产品自身抑菌性实验数据，菌种回收率和培养基合用性和敏捷度检查数据，菌种的传代、销毁和使用记录，无菌检查操作记录、培养记录等。无菌检查中偏差的解决与否真的找到了主线因素，与否在没有确切的因素前就对样品重新检查并根据新的检查成果放行产品。 验证的措施与无菌检查操作规程和无菌检查记录与否完全一致,如操作环节、检查措施、检查环境、实验耗材均需与实际检查操作规程及验证过程完全相符。 为了考察验证措施的稳定性和重现性，验证时与否至少采用了3个不同批次的同类样品，分别进行了3次验证明验。使用新的滤膜或过滤器(不同厂家或批号、型号）与否重新进行样品实验组、

12、蛋白胨对照组和阳性对照组的验证确认。除非样品不能采用过滤的措施(难溶解)，公司与否采用全封闭的薄膜过滤法。菌液的保存条件和保存期限与否符合药典的规定，对于黑曲霉孢子悬液与否有验证的资料。无菌检查的注意事项 培养基的合用性检查涉及培养基的无菌性检查和培养基的敏捷度检查。中国药典附录中规定的检查数量不涉及阳性对照用样品量,虽然附录另处有专门阐明,仍然容易忽视。 无菌检查时应强调“检查数量”，重要是保证明验成果的代表性，而阳性对照实验和验证时仅须满足“检查量”总量规定即可，以保证明验成果的可靠性，验证明验可以由此减少大量的样品； 工作菌株的传代次数不得超过5代,以避免过度的传代增长菌种变异的风险。这

13、里“代”的定义是指,活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养,任何亚培养的形式均被觉得是转种或传代一次。 菌液加入，按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液,重要是考虑过滤器的有效性。过滤器的有效性应由提供公司控制,顾客可采用合适措施抽查（如检查阳性菌液通过滤筒的流出液)。 实验室菌种的解决和保存的程序应原则化,以尽量减少菌种污染和变异。 实验时菌悬液并不是只要活的菌体就行,而是要保持旺盛的生命力,因此菌悬液寄存时间不能太长。 菌液制备后若在室温下放置，应在?h内使用，若保存在28，可在2？h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用。 薄膜过滤法采用大样品量集菌的措施，具有

14、代表性,不易漏检，仪器操作相对简朴。该系统是全封闭过滤系统,避免了操作过程中外源性微生物的污染,对实验成果的可信性影响较小。因此无菌实验采用薄膜过滤法还是直接接种法并不依赖于验证成果，而是取决于样品的特性，如能采用过滤的措施均应采用薄膜过滤法检查。若样品具有抑菌成分,当采用薄膜过滤法时，应先将供试液稀释后在过滤，这样可以减少滤膜对样品的吸附，减少冲洗量,进而减少微生物的损失或伤害。 无菌检查应作为稳定性考察的项目进行，以便对产品有效期的制定和合理的拟定储存条件提供重要的根据。阳性成果的调查：在无菌检查中必须小心避免任何也许污染样品的行为。一旦发现微生物生长,该批产品就被判断非无菌,必须进行调查。只有可以导致微生物生长的明确因素被找出,方可觉得最初的阳性测试成果无效。只有拟定且书面记载的证据清晰地证明污染发生在测试过程中,方可进行重新测试。如果已有证据不明确，产品也必须按照不符合无菌需求的产品那样回绝放行并报废。在综合考虑所有与产品制造和样品测试有关的因素后，必须汇总成为书面的调查报告,涵盖确切的结论和整治措施。 实验操作流程及数据的关联性、衔接及可追溯性。如仪器使用记录和实验记录的一致,智能集菌器型号数量与实验记录一致,菌种收、存、使用记录与实验记录的一致。