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1、植物体内转化酶活性的测定植物体内转化酶活性的测定转化酶又称蔗糖酶（6D一吠喃型果糖苷一果糖水解酶），是一种水解酶。 植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶。它能将植物体内的主要同化 产物一一蔗糖不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖类贮库提供可 利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作 用偶联的氧化磷酸化产生能量。所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系， 是衡量同化产物的转化和利用，植物细胞代谢及生长强度的指标。源理】转化酶可将非还原性糖的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。将从植物组织中提取 的酶液与蔗糖溶液保温作用一定时间后，测定产生的还原糖的量来表示转化酶 活性
2、的大小。在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还 原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它产 物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例 关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中 还原糖的含量。通常，在测定过程中，溶液的pH对酶活性影响很大。不同的酶及不同材料 中同一种酶都有其最适的pH值。转化酶有两个影响水解蔗糖能力的解离基团， 一个PKa约为7,另一个PKa约为3。不同植物材料的转化酶中这两个基团的含 量不同，它们的最适pH也不同（最适pH在7.0左右的为中性转化酶，最适
3、pH 在7.0以下的为酸性转化酶）。所以，在测定材料中转化酶的活性之前，首先要 选择适宜的PH值。【材料、仪器与试剂】1 .材料：植物组织2 .试剂：（1）提取缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl （PH7.0）缓冲液，内含 5 mmol/L MgCl2, 2 mmol/L EDTA-Na2,2% 乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSA），2%PVP，5 mmol/LDTT。（2）透析缓冲液:25 mmol/L Tris-HCl （PH7.0）缓冲液，内含2.5 mmol/L MgC, 1 mmol/L EDTA-Na2,1% 乙二醇,1 mmol/L DTT。（3）酶反应液：80 mm
4、ol/L乙酸-K3PO4（pH4.7和pH7.0）缓冲液，内含50 mmol/L 蔗糖。（4）葡萄糖标准液：1 mg/mL。（5）3，5-二硝基水杨酸试剂：精确秤取1g 3，5-二硝基水杨酸，溶于20 ml 2 mol/LNaOH溶液中，加入50 ml蒸馏水，再加入30 g酒石酸钠，待溶解后用蒸馏水定 容至100 ml。盖紧瓶塞，勿让CO2进入。若有浑浊可过滤后使用。材料：小麦叶片、籽粒。3 .设备冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量 0.01mg）, 1 mL移液管5支，5 mL带塞试管10支。【方法与步骤】1 .酶的提取：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分
5、批加入5ml提取缓 冲液，冰浴研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml装入透析袋中， 透析袋置于透析缓冲液中4度透析过夜，期间更换透析液3次，透析后酶液定容 5ml备用。2 .酶反应：取3支5 mL具有试管，加入0.95 mL反应液和50叫 透析后 的酶液，30C。水浴中反应10 min中止反应。用煮死酶液作对照（煮沸 10min）。3 .还原糖含量的测定：往各反应试管中再加3, 5-二硝基水杨酸试剂1 mL,沸水浴5 min，冷却至室温，于540nm比色测定生成的还原糖量。4 .标准曲线制作：取7支5 ml具塞试管，编号，按下表配置加入各种试 剂液，并按上述步骤3进行，测定其吸
6、光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖 含量为横坐标，绘制标准曲线，计算反应生成的葡萄糖量：管号12345671mg/mL葡萄糖标准 液（ml）00.10.30.40.60.81.0加蒸馏水量（ml）1.00.90.80.60.40.203, 5-二硝基水杨酸（ml）1.01.01.01.01.01.01.0葡萄糖含量（mg）00.10.20.40.60.81.0A 5405.结果计算：酶活力以mg葡萄糖g-iFWh-i表示C xV酶活力（mg葡萄糖g-1FWh-1）二V x nFW x t x VS【结果与计算】转化酶的活性用还原糖量（mg/gfwh）表示，计算公式如下：C表示从标准曲线查得的葡
7、萄糖量（mg）；FW表示组织鲜重（g）；t表示反应时间（h）；Vt表示提取酶液的总体积（mL）七表示测定时取用酶液体积（mL）n表示提取液测定中的稀释倍数。转化酶的测定转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性 的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物一一蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果 糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚 糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与 植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生 长强度的指标。试剂：1、10%蔗糖溶液2、葡萄糖标准液（500Rg/ml）3
8、、0.05mol/l的磷酸缓冲液4、（DNS） 3, 5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH 溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫 酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆， 定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提 液。2、酶活性的测定：吸酶液2ml,放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及 10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨 酸
9、法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标 准液：管号123456葡萄糖原液量00.40.81.21.62.0（ml）加蒸馏水量2.01.61.20.80.40（ml）葡萄糖浓度（R0100200300400500g/ml）在上述各管中分别加入1.5ml 3, 5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混 匀，以1号管为空白，测540nm波长下的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓 度为横坐标，绘制标准曲线。酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3, 5二硝 基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml，测定540nm波长下的 OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。4、结果计算：A=(N-N)*V/(T*W*1000)A :转化酶的活性(mg/gfw/h)N :酶反应液中还原糖的浓度(Rg/ml)N ：钝化酶反应液中还原糖的浓度(Rg/ml) V ：酶反应液的总体积T :反应时间W :材料鲜重
