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1、第一章1.理解 Genomes, Transcriptomes 和 Proteomes 三个名词，并阐明它们在基因组表达过程中是如何联系在一起的；Genomes:基因组（Genome）：由德国汉堡大学威克勒教授于1920年首创，指生物的整套 染色体所含有的全部DNA或RNA序列。基因组是地球上每一物种具有的生物学信息的存 储库。基因组学（Genomics）：由罗德里克于1986年首创，指研究生物的整个基因组，涉及基因 组作图、测序和功能分析的一门学科。Transcriptomes：基因组表达的最初产物是转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信 息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。
2、-转录组中的RNA分子以及其他来自非编码基因的RNA都由转录过程产生。-Proteomes：基因组表达的第二个产物是蛋白质组，即细胞中那些决定细胞能够进行 生化反应的所有蛋白质组分。- 这些蛋白质是通过翻译那些组成转录组的mRNA分子而合成的。-蛋白质组包括了在特定时间存在于细胞中的所有蛋白质。阐明三者在基因组表达过程中是如何联系在一起的？-基因组所包含的生物信息的利用需要酶及其他参与基因组表达过程中一系列复杂生 化反应的蛋白质的协同活性。-基因组表达的最初产物是转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码 蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。转录组由转录过程来维持。-基因组表达的第
3、二个产物是蛋白质组，即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的 所有蛋白质组分。这是通过翻译过程来完成的。 The genome tells you what could be happened theoretically in the cell. Transcriptome tells you what might be happened. And the proteome tells you what is happening.2. 掌握双螺旋结构的关键特征；Watson and Crick （1953）提出的DNA双螺旋结构模型： DNA分子通常以右手双螺旋形式存在，两条核苷酸链反向平行，且
4、互为互补链；戊糖一磷酸骨架在分子的外铡，在分子表面形成大沟和小沟，碱基堆积于螺旋内部;碱基间通过氢键相互连接，A和T以2个氢键配对，G和C以3个氢键配对； 螺旋中相邻碱基间相隔0.34nm，每10个碱基对螺旋上升一圈，螺距为3.4nm，直径 为 2.37 nm。3.正确区分编码RNA和功能性RNA；4. 描述蛋白质结构的不同层次;蛋白质和DNA分子一样，是一个线性的无分支的多聚体。蛋白质中的单体亚单位称为氨 基酸。氨基酸形成的多聚体或多肽在长度上很少超过2000个单位。 a. primary structure氨基酸通过肽键连接成一条多肽链。 b. secondary structure指多肽
5、采取的不同构象，由不同氨基酸之间形成的氢键所稳定。a螺旋；p片层 c. tertiary structure是将多肽链的二级结构组分折叠成为三维构型而形成的。 d. quaternary structure两条或更多已形成三级结构的多肽链组合在一起形成一个多亚基蛋白质。不是所有 蛋白质都有四级结构5. 掌握转录组学和蛋白质组学的一般研究方法，特别是SAGE技术、微阵列和基因芯片技术以及鉴定蛋白质相互作用的技术（噬菌体展示、酵母双杂交等）。转录组研究的方法A. 通过序列分析研究转录组研究转录组最直接的方法是将其中的mRNA转变为cDNA，并对所有cDNA克隆进行测序， 再与基因组序列进行比较分析
6、。还可以借助第二、三代测序技术直接对RNA进行测序。基因表达系列分析（Serial analysis of gene expresion, SAGE）SAGE技术不是研究完整的cDNA，它产生长度12bp的短序列，每一条都代表了转录组中 存在的一种mRNA。技术基础：412=16,777,216 bp，真核mRNA平均1500 bp，412相当于 11,000个转录物，这比最复杂的转录组中存在转录物数目还多，因此12bp序列能够代表某 一种mRNA。BsmF1是一种不常见的限制性内切酶，它不在其识别序列内部，而是在识别 位点下游10-14个nt处切割。切下来的片段被收集起来，头尾相连以产生一个
7、串联体，进 行测序分析。串联体中的各个标签序列信息被读取并与基因组中的基因序列比对，从而可以 分析哪些基因被转录，表达水平如何。B. 通过微阵列或芯片分析来研究转录组构成转录组的mRNA总体被反转录成一个cDNA的混合物，然后被标记，用于和芯片或微 阵列杂交。优点：可用于快速评估两个或多个转录组间的差异。Microarray:玻璃片，尼龙膜（PCR产物或cDNA ）DNA chip:玻璃片，硅片（原位合成并固化的寡聚核苷酸）用不同的荧光来标记cDNA样品，微阵列与两个样品同时杂交，可以减少由于试验误差引 起的差异。蛋白质组研究的方法A.蛋白谱（表达蛋白质组学）用来研究一个蛋白质组组成的特定技术
8、。蛋白谱基于两项技术：蛋白电泳和质谱a. 双向电泳：等电点：蛋白质的净电荷为零时溶液的PH值。b. MALDI-TOF （基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）-用于鉴定蛋白组中的蛋白质，最多可以分析出50个氨基酸长度的多肽，因此一个蛋 白质可以通过胰酶将其消化后进行测定。-一旦多肽片段被离子化，多肽的质量/电荷比就可以通过它在质谱仪中从电离源到检 测器的“飞行时间”来确定。通过质荷比能够确认多肽片段的分子质量。-计算机中含有一个由所研究的物种基因组编码的每一个蛋白质经胰酶消化后各个片 段的预计相对分子质量的数据库，计算机通过比较数据库与检测到的多肽片段的分 子质量来确认最可能的初始蛋白质。B.
9、蛋白质印迹法（Western杂交）-Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。-其原理是：生物中含有一定量的目标蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目标蛋白， 将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按 分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼 龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。-然后加入特异性抗体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与 一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免 疫球蛋白抗体），最后通过二
10、抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸 酶，或用同位素或生物素标记）的特异性反应进行检测。-根据检测结果，从而可得知被检生物细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量 等情况。C. 鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质通过鉴定有相互作用的成对或成组的蛋白质能够获得基因组活性相关的重要数据。构建蛋白 质相互作用图谱被视为是连接蛋白质组学与细胞生物化学过程的一个重要步骤。a. 噬菌体展示该技术采用了一种基于噬菌体或某种丝状噬菌体的独特的克隆载体。待测基因被插入载 体后，它的蛋白质产物能与噬菌体外壳蛋白以融合形式表达。使用噬菌体展示库来寻找与待 测蛋白质相互作用的蛋白质的噬菌体。b. 酵母双杂交
11、激活因子（转录因子）：一类控制基因表达的蛋白质，包含DNA结合结构域和转录激活结 构域。双杂交系统使用缺乏某一报告基因相应激活因子的酿酒酵母菌株，此时报告基因是不 表达的。D. 蛋白质相互作用图谱也叫蛋白质相互作用网络，能展现一个蛋白质组中各成员间发生的相互作用。第二章1. 列举用于DNA操作的不同类型酶的特征及主要作用；（1）末端修饰酶：改变DNA分子末端，为连接实验的设计增加可操作空间。A. 末端脱氧核糖核昔酸转移酶：属于模板非依赖的DNA聚合酶。B. 碱性磷酸酶：去掉DNA分子5端磷酸基团，从而阻止这些分子连接到其他分子上。C. T4多聚核昔酸激酶：向DNA分子5端添加磷酸基团，主要用于
12、DNA分子的末端标记。（2）DNA聚合酶:以现有DNA或RNA分子为模板合成DNA的酶，称为（依赖模板的）DNA聚合酶。DNA聚合酶I （Kornberg聚合酶）:53聚合酶功能 53外切功能 3-5外切功能 Klenow聚合酶：用枯草杆菌蛋白酶处理DNA聚合酶I,可获得两个片段，大片段的分子质 量约76 kDa，保留聚合酶活性和3-5外切核酸酶活性，又叫Klenow片段。小片段的分子 质量约34 kDa，具有5-3外切核酸酶活性。核酸酶:外切核酸酶和内切核酸酶（4）DNA连接酶:通过DNA连接酶可以将限制性内切核酸酶消化产生的DNA片段重新连接 起来，或者连接到一个新的分子上。T4 DNA连
13、接酶：从T4噬菌体感染后的大肠杆菌细胞中提取。2. 说明三种类型的限制性内切酶切割DNA的方式；限制性内切核酸酶在特定的位置切割DNA分子：按限制性内切酶的组成、是否具有修饰酶 活性以及切断核酸的情况不同，限制酶可分为三类：I型，II型和m型。a. I和III型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的降解， 但切割位置不固定。b. II型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的降解（无修饰酶活性），且具有识别位点的专一性和切割位点的专一性，一般在识别序列内切割，不需要ATP提供能量，是重组DNA 技术中常用的限制性内切酶。细菌中三种不同类型的限制-修饰酶IIIIII酶分子双
14、功能不同酶双功能识别位点两部分/不对称4-8 bp回文结构5-7bp不对称切割位点非专化1000 bp from RS与识别位点同/附近识别位点下游24-26 bpR & M相互排斥不在同一个分子中同时竞争ATP需要不需要需要3. 区分平端与粘端连接，并说明如何提高平端连接的效率;粘性末端连接的高效率推动了将钝末端转变成粘性末端方法的发展。 一种方法是将称为连接子（linker）或接头（adaptor）的小双链分子连接到钝末端。-另一种方法是利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶进行同聚物加尾，即在钝末端的3末 尾一个接一个地添加核苷酸。4. 详述克隆载体的主要特征；质粒，噬菌体，人工染色体等，它们都含
15、有复制起始位点。A. 以大肠杆菌质粒为基础的载体pUC系列：pUC8, 2.7kb，除了起始位点外，还携带氨苄青霉素抗性基因（pUC8的选择性 标记）和lacZ基因（编码-半乳糖苷酶的一部分）。某些大肠杆菌菌株具有一个修饰的lacZ 基因，该基因中缺失lacZ,部分。B. 建立在大肠杆菌噬菌体基因组基础上的克隆载体最初尝试着发展能操作大片段DNA分子的载体集中在人噬菌体上。人噬菌体存在两种感染周期：裂解性感染周期；溶源性感染周期人噬菌体基因组大小为48.5 kb，其中有15 kb为随意区域，可以被删除而不影响噬菌体感染 细菌的能力。据此，目前发明了两种类型的载体：插入型载体：该载体中部分或全部随意DNA被删除， 并在删切后的基因组内部的某些位点引入一个单一的限制性酶切位点。用插入型载体进行克 隆：人噬菌体基因组是一个线性分子，但其两个末端具有12个核苷酸的单链突出，称为cos 位点。cos位点序列与人噬菌体的体外包装密切相关。替代型载体：该载体中随意DNA位于一填充片段内，两侧有一对限制性酶切位点，当要克 隆的DNA连接到该载体时，这个区段就被取代。C.用于更长DNA片段的载体a. 考斯质粒（cosmid）、黏粒
