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1、实验 19 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定I考马斯亮蓝 G - 250染色法一、原理考马斯亮蓝 G - 250 （ Coomassie brilliant blue, G-250 ）法是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式， 红色和蓝色。 它和蛋白质通过范德瓦尔键结合， 在一定蛋白质浓度范围内， 蛋白质和染料结合符合比尔定律。 此染料与蛋白质结合后颜色由红色 形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ，通过测定 595 nm 处光吸收的增加 量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合
2、是一个很快的过程， 约 2 min 即可反应完全， 呈现最大光吸收， 并可稳定 1 h ， 之后，蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀岀来。此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同 来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料植物材料。（二）试剂1. 标准蛋白质溶液（100卩g / mL牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液 40 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL 即可。2. 考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝
3、G-250 ，溶于 50 mL 90 乙醇中，加入 100 mL85 （ W V ）的磷酸， 再用蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。 常温下可保存一个月。（三）仪器设备分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。三、实验步骤1. 标准曲线的绘制取6支试管，按表26 - 1加入试剂，摇匀，向各管中加入5 mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，在 595 nm 下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐 标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。2. 样品测定（1 ） 样品提取 称取鲜样0.250.5 g ，用5 mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，30
4、00r/mi n 离心10 min ，上清液备用。（2 ）吸取样品提取液1.0 mL（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复 2次）， 加入5 mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置 2 min 后在595 nm 下比色，测定吸光度，并通过标 准曲线查得蛋白质含量。表26-1绘制标准曲线的各试剂加入量试剂管号012345标准蛋白质（mL ）00.200.400.600.801.00蒸馏水量（mL ）1.000.800.600.400.200蛋白质含量（卩g ）020406080100四、结果计算样品中蛋白质的含量=式中：C查标准曲线值，卩gV T 提取液总体积，mL 。W F 样品鲜重，g
5、。V S测定时加样量，mLn Lowry法（劳里法）、原理Lowry法是双缩脲法（Biuret ）和斐林（Folin ）-酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应,形成铜-蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定,很容蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。 Lowry 法除使肽链中络氨酸、色氨酸 和半胱氨酸等显色外， 还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈， 其显色效果比单独使用酚试剂强315倍，约是双缩脲法的 100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起 的偏差。
6、Lowry 法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对于不溶性蛋白和 膜结合蛋白必须进行预处理（如加入少量的 SDS ）。1. 双缩脲法的原理 双缩脲（NH 2 - CO - NH - CO - NH 2 ）在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物， 这一反应称为双缩脲反应。 因为蛋白质中有多个肽键， 也能与铜离子发生双 缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便， 可测定的范围为 1 10 mg 蛋白质，适于
7、精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约 0.5 mg 以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括 在性质上是氨基酸或肽的缓冲液， 如 Tris 缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应， 铜离子也容易 被还原，有时出现红色沉淀。2. 斐林（ Folin ）-酚法的原理 该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原， 生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650 nm 时比色测定的灵敏度比双缩脲法高 100 倍。反应约在 15 min 内有最大显
8、色，并至少可稳定几小时。此法也 适用于测定酪氨酸、 色氨酸含量。此法的优点是操作简单， 迅速，不需特殊仪器设备， 灵敏度高。 其不足之处是此反应受多种因素干扰。在测试时应排除干扰因素或做空白试验消除。二、试剂与仪器设备（一）试剂Na 2 WO 4 2H 2 O , Na 2 MoO 4 2H 2 O , 85 % H 3 PO 4 ，浓 HCI , Li 2 SO 4 H2 O，溴水，酚酞指示剂， Na 2 CO 3 , NaOH , CuSO 4 5 H 2 O ，酒石酸钾钠，牛血清 白蛋白。1. 碱性铜试剂（相当于双缩脲试剂）的制备 首先配制 A 液： 4 %碳酸钠（ Na 2 CO 3
9、）溶液与 0.2moI/L 氢氧化钠（ NaOH ）溶液等比例混合（ 2 % Na 2 CO 3， 0.1 moI NaOH ）；B液：1 %硫酸铜（CuSO4 5H 2 O ）溶液与2 %酒石酸钾钠溶液等比例混合（0.5 % CuSO4 5H 2 O , 0.1 %酒石酸钾钠）。在使用前将A液与B液按50 : 1的比例混合即成。此为 FoIin- 酚试剂甲液，此试剂只能使用 1 天。2. 酚试剂（相当于 Folin 试剂）的制备 称取钨酸钠（ Na 2 WO 4 2H 2 O ）100 g ，钼酸钠（Na 2 MoO 4 2H 2 O ）25 g ，加蒸馏水 700 mL 溶解于1500 m
10、L 的圆底烧瓶中。之后加入 85 %的 H 3 PO 4 50mL ，浓 HCl l00mL ，安上回流装置（使用磨口接头，若用软木 塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来），使其慢慢沸腾10 h 。冷却后加入硫酸锂（ Li 2 SO4 H 2 O ） 150g ，水50 mL，溴水23滴，不用回流装置开口煮沸15 min ，以逐岀过量的溴。待冷却后稀释至 1000 mL ，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存（冷却后溶液呈 黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15 min ）。使用时用标准 NaOH 溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰。滴定后算岀酸的浓度。使用时大约加水1倍，
11、使最终浓度相当于1 mol/L H + 酸，此为Folin-酚试剂乙液（Folin 试剂）。在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在pH 10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。3. 标准蛋白质溶液的配制称取25 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，使终浓度为250卩 g /mL 。（二）仪器设备试管，移液管，定量加样器，圆底烧瓶，冷凝管1套（带橡胶管），微量滴定管，小烧杯，微量进样器50卩L 1支，分光光度计，恒温水浴器，研钵，玻棒，离心机，离心管三、实验步骤1. 标准曲线的绘制
12、（1 ）取7支试管，编号后，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足 l mL ,使每管含蛋白量分别为 0、25、50、100、150、 200、250卩g （必要时可做重复）。（2 ）在每支试管中用定量加样器加入5 mL甲液，混匀，于 30 C下放置10 min 。（3 ）在每支试管中喷射加入0.5 mL 乙液，立即振荡混匀，在 30 C下保温30 min 。（4 ）准确到30 min 后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500 nm 下用1 cm 光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐
13、标，绘制标准曲线。2. 样品的测定（1）样品的提取 与考马斯亮蓝 G-250法相同。取1.0 mL （视蛋白质含量适当稀释）样液加入试管中，然后重复步骤1的（2 ）（4 ），以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。（2 ）根据光密度值查标准曲线，求岀比色液中的蛋白质含量。四、结果计算样品中蛋白质的含量=(mg/g )V T 提取液总体积 , mL 。W F 样品鲜重 , g 。V S 测定时加样量 , mL 。注意： 还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干 扰皿紫外吸收法一、原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性 质，吸收高峰在 280 nm
14、波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A 280 ）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：（ 1 ）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（ 2 ） 若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。 但可作为初步定量的依据。二、试剂与仪器设备（一）试剂0.1 mol/L pH 7.0 磷酸缓冲液
15、。蛋白质标准溶液：准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1 mg/mL 的溶液。（二）仪器设备紫外分光光度计，离心机，刻度移液管。三、实验步骤1. 标准曲线法(1 )标准曲线的绘制取8支试管，按表26 - 2分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程1 cm的石英比色杯，在 280 nm波长处分别测定各管溶液的A 280值。以A 280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。表26-2绘制标准曲线各试剂加入量试剂管号12345678标准蛋白质溶液(mL )00.51.01.52.02.53.04.0蒸馏水(mL )4.03.53.02.52.01.51.00蛋白质浓度(mg/mL )00.1250.250 (.3750.5000.6250.7501.00(
