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1、胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中， 分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍 了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化 方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 生物提取法生产胃蛋白酶11 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜f自溶液f上清液 （浓缩、干燥） f胃蛋白酶成品1.2 工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时
2、剥取的粘 膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平 均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸3.6-4升，加 热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持4548度， 消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去 杂质：将滤液降温至30C以下，加入15-20%氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置 24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40C以 下减压浓缩至原体积的14左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-
3、100目筛，即得胃蛋白 酶粉。2胃蛋白酶的分离技术2.1 有机溶剂法 可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉 淀蛋白质的能力为：丙酮异丙酮乙醇甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要 受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵， 所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。22 盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的 最多的是硫酸铵。美国专利（2， 701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮） 在50%-55%、pH在5.05.2时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉
4、淀物为胃酶的锌盐，然 后用金属螯合剂除去锌盐，得1500016000倍活力的酶，收集率为5.0%-5.5%。此法较上 述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。2.3 底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋 白酶。使底物和酶在 pH2.5 的乳酸缓冲液中充分结合，然后调 pH 至 4（底物的等电点）沉 淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的 SDS 将底物和酶 分离，得到酶一SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋 白酶进行了实验室分离，得率大约为 30%。与传统的分离方法比较，此法
5、具有简单高效的优 点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】2.4透析法胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性 而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就 会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换23 次。如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却， 避免样品变性。透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。【1】3 胃蛋白酶的纯化技术3.1 凝胶过滤法美国在20世纪60年代研究结晶为蛋白酶的生产工艺时，是将75mg的胃蛋白酶原样本溶解 在8mL的蒸馏水中(pH5. 06. 0),在1
6、4C1。，pH2. 0下，保持20min激活。然后用磺 乙基Spandex G-25层析，最后用羟基磷灰石进行色谱层析。结果表明用层析法得到的胃蛋 白酶为单一物质纯品。3.2 离子交换层析法陈躬瑞等人在纯化蕲蛇胃蛋白酶时将SDS沉淀后的上清液上样到预先用0.05mol / L乙酸缓 冲液(pH5.0)平衡的DEAETOYOPEARL离子交换色谱柱(4.6mm X 100mm)上，用0O.25mo1 / L氯化钠梯度洗脱，流速为1ml / min。得到的酶在5OC30min有较高的活性，有望应用 于高温食品加工中。【2】基于以上对胃蛋白酶的分离纯化技术的比较分析可以看出，长期以来分离提取技术一直
7、没有 取得较大的突破，用有机溶剂、盐析等技术得到的天然胃蛋白酶产品，纯度、生物活性愈将 不能满足医药品和工业日益增长的需要。随着分离科学技术的不断发展，采用新型分离技术 分离胃蛋白酶已势在必行。因此，大多数学者认为以下几种技术是胃蛋白酶分离纯化的方向。3.2. 1 有机溶剂与盐析共沉淀 有机溶剂和盐析法都是分离纯化胃蛋白酶的传统方法，有其各自的特点。如果将有机溶剂和 盐析配合使用，不仅可以降低盐的用量，而且可以不同程度的消除各自分离纯化所带来的问 题，得到的胃蛋白酶纯度和活性也会有所增加。3.2.2 膜分离技术 分离膜是一种特殊的、具有选择性透过功能的薄层物质，能利用分子大小实现分离，从而起
8、到浓缩和分离纯化的作用。由于其可在维持原生物体系环境的条件下实现分离，并可高效地 浓缩、富集产物，有效地去除杂质，加之操作简单，结构紧凑、能耗低，过程简化，无一次 污染，也将成为胃蛋白酶分离纯化工艺的研究方向。3.2.3 等电点沉淀法与底物亲和法胃蛋白酶具有极低的等电点(如猪胃蛋白pH1. 0),但胃蛋白酶的分离纯化技术中等电点沉淀 法未见报道，如果此方法可实现，那将大大缩短分离纯化的时间。底物亲和法是分离纯化胃 蛋白酶的新亮点，但其工艺条件还不成熟，尤其是在分离底物和酶的复合物时，SDS的添加 量有待研究。4 结论有人预言，21 世纪将是生物技术的世纪，尤其是生物制药技术的世纪。生物制药被誉
9、为21 世纪的“朝阳产业”。得益于生物制药技术的酶类药物也日趋成熟。高效的胃蛋白酶分离纯 化工艺、技术和设备的出现，人们必将开发出高效的胃蛋白酶提取工艺。这对于提高功能性 胃蛋白酶产品、提高生产率、降低生产成本和改善人民生活水平起着举足轻重的作用。而胃 蛋白酶单一组分的制备分离，可为胃蛋白酶的研究开发提供标准品，同时能为后期胃蛋白酶 单一组分生理活性的研究提供必要的物质保障。参考文献1张继平，郭照良，唐东生等暗纹东方纯胃蛋白酶的分离纯化及部分性质研究J，湖南农业大学学报， 2004(30)：526-529陈躬瑞、柯李晶、赵恒裕等.底物亲和法分离纯化薪蛇胃蛋白酶J，中国食品学报,2001(1)：5O-553黄纯，生物化学，科学出版社，北京， 2004.9 ， 18-49
