双向电泳操作步骤

《双向电泳操作步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《双向电泳操作步骤（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、双向电泳操作步骤水化上样（被动上样）1. 从冰箱中取出IPG胶条，室温放置lOmino2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各lcm左右不加样，中间的样品液一 定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。3. 用蹑子轻轻撕去IPG胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背 面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条卞面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用蹑 子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。5. 放置3045min人部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根

2、胶条约 3ml（17cmlPG）,防止胶条水化过程中液体蒸发。6. 置等电聚焦仪于20C水化ll15h。第一向等电聚焦1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，力口 ddH2O 58|11润湿。2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝卞，将其置于刚好润湿的滤纸片上 杂交以去除表面上的不溶物。3. 将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保 胶条与电极紧密接触。4. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油。5. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中， -20C冰箱保存

3、，电泳前取出胶条，室温放置10分钟，使其溶解。第二向SDS-PAGE电泳1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶。2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。3. 配制胶条平衡缓冲液I4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸 用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余 样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml（17cmlPG）平衡缓冲液I ,在水平摇床上缓慢摇 晃15分钟。6. 配制胶条平衡缓冲液II o7. 第一次平衡结束后，

4、取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II中， 继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。8. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶 部面对自己。9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。10. 在100ml量筒中加入TGS电泳缓冲液。11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免 损失蛋白或损坏凝胶表面）。12. 用蹑子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在lx电泳缓冲液中漂洗数次。13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。14. 用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完

5、全接触。注 意：不要在胶条卞方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到面胶。15放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。16. 打开二向电泳制冷仪，调温度为15017. 将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用的低电流 (5mA10mA/gel/17cm),待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后，再加人电流 (20-30mA/gel/17cm)待漠酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。18. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴手套，防止污染胶 面)19. 进行染色。双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的壑眩不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量 的不同

6、用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多 方面改进已成为研究蛋自质组的最有使用价值的核心方法。原理编辑1、根据蛋白质的等电点(第一向)和分子量(第二向)的不同进行分离。2、电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色,然后用相关软 件对电泳图彖进行分析。操作步骤编辑样品要求1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M尿素/4%CHAPS/40mMTris (Base) /65mM DTT：2、样品浓度大于2 ng/ pil；样品制备双向电泳成功的关键在于建立一套有效的、可重复的样品制备方法。样品制备的影响因素包 括蛋白质的溶解性、分子量、电荷数及

7、等电点等。对于不同的劇性质及研究目的，其方法 也不尽相同。不同的样品性质，用于样品处理的缓冲液必须在低离子强度的基础上,既能 保持蛋白质的天然电荷。又能维持其溶解性。因此，绝人多数样品往往都需要通过多次实验 才能摸索到最适宜的条件。第一向分离等电聚焦蛋白质是两性分子，在不同的pH坏境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质 来说都有一个特定的pH,此时蛋白质的静电荷为零,此pH值即该蛋白质的等电点(pl)。将 蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。 在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质土，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数 和迁移速度下降。

8、当蛋白质迁移至其等电点PH位置时,其净电荷数为零,在电场中不再移 动。聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的 pl值;在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。第二向分离SDS.聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS.PAGE凝胶上， 根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质.SDS复合物，由于SDS是一种强 阴离子去垢剂.所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的迪量，能消除不同分子之间原有 的电荷差异，从而使得凝胶中电

9、泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响.而主要取决于蛋白 质分子的质屋大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系,在蛋白质组研究中。需要在同样 的条件下同时走多块胶，这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。修饰和加工蛋白质的翻译后修饰和加工,是指在施合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、疑基化、 糖基化、二硫键形成,以及目前发现的蛋白质自剪接等等,可能有一百种以上。翻译后修饰 和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。用双向凝胶 电泳可以进行翻译后修饰的研究,如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化。双向凝胶电泳 中常可发现的蛋白质拖曳现象，很可能是一个蛋白的不同翻译后修饰产物所造成

10、的。拖曳图 像变化在疾病诊断上可能提供重要的信息。3技术应用编辑凝胶中蛋白的检测凝胶染色的目的是使其中的蛋白质能够被观察到。目前还没有通用的染色方法，只能在考虑 多种因素如需要的灵敏度、线性范闱、方便程度、费用、以及成像设备类型等基础上，结合 实际进行选择。有时也可以将蛋白转膜后通过兔疫輕的方法来进行检测。图像采集和分析成像设备可以摄人图像，对凝胶图像以数字形式保存，对每块凝胶图像进行平等的比较，在 各研究组之间传递信息，并对人量的数据进行归类分析。目前应用较为广泛的图像分析软件 有 PDQuest、ImageMaster 2D Elite Melanie、BioImage Investiga

11、tor 等，分辨率较高,功能齐 全。尽管如此，仍不可避免约10%的未检出点和假点，需要手工添加、删除和分割。图像采 集完成后。可以应用各种分析软件进行分析，可以收集、诠释、比较蛋白质组数据谥料等。 蛋白鉴定一旦通过差异分析或其它方法找到感兴趣的蛋白后.就可以从凝胶中或膜上切取这些目标蛋 白质作鉴定。现在绝人多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成的。分离蛋白质组所有蛋白分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。在目前情况下，双向凝胶电 泳的一块胶板(16cmx20cm可分出34 T个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10 万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。80年代开始采用固定化

12、pH梯度胶，克服了戴 体两性电解质阴极漂移等许影缺点而得以建立非常稳定的町以随意精确设定的pH梯度。由 于可以建立很窄的pH范閑(如0.05U/cm),对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范闱内做第 二轮分析，从而人人提高了分辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电 泳重复性的问题。这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂 直板虫述和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10100kD分子量的蛋白质。其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记,20ppm的标 记蛋白就可通过其盘或磷光的强度而测定。用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置町

13、 把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景 底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓参 考胶图谱”。蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白,进行定性和定 量的分析。最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再 进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。现在的分级分竝是先做快速的氨基酸组成分析, 也可先做45个循坏的N末端微量龌，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的 等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。有文献报道，N末端4

14、个 残基序列的数据就町以给出很多的信息而得到相当准确的结果。如再结合C末端序列，判断 结呆的准确性会更高。对分离得到的蛋白质作进一步的确切鉴定需要有足够数量的纯蛋白, 电泳时蛋白质已经过了高度纯化。现在一块胶板可允许上到高达mg数量级的样品，因此每 个分离的蛋白斑点可有Hg数量的蛋白，这样使本来是微量的蛋白也可希冀被鉴定。4存在问题编辑(1) 低拷贝蛋白的鉴定。人体的微屋蛋白往往还是重要的调节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵 敏度的方法外，最有希望的还是把企廈辅助的激光解吸/离子化竝用到PVDF膜上，但当前 的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。(2) 极酸或极碱蛋白的分离。极大(200kD)或极小(10kD=蛋白的分离)。(4) 难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白(5) 得到高质屋的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。