弓形虫慢性感染小鼠脑内长链非编码RNA(lncRNA)的差异表达及作用机制的研究

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1、弓形虫慢性感染小鼠脑内长链非编码RNA(IncRNA)的差异表达及作用机制的研究弓形虫是细胞内寄生原虫,呈世界性分布,广泛寄生于人和动物的有核细胞内。能够感染所有温血动物,包括人,引起人畜共患弓形虫病。血清学调查结果表明,全世界约有30%的人感染弓形虫。免疫功能正常的宿主感染弓形虫后,一般表现出没有明显症状的感染情况。现在的研究表明,弓形虫的这种隐性感染模式虽然没有明显的症状,但是能够侵入宿主的神经系统,影响神经细胞的功能,从而导致宿主脑损害,甚至精神疾病的发生。现在,越来越多的证据表明弓形虫慢性感染能影响神经细胞损伤并参与神经系统疾病。新近研究发现，Non-codingRNA(ncRNA)是

2、基因组中一类重要的非编码RNA,不具有蛋白编码功能,但是在生命过程中却发挥着重要的调控功能。其中长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)的长度大于200个核苦酸,作为神经系统一类重要的非编码RNA通过与靶基因mRNA合，调控基因转录后表达，在许多神经相关性疾病中起着重要的调节作用。在本研究中，我们用PRUtt弓形虫包裹经口感染小鼠，建立弓形虫慢性感染小鼠模型,通过微阵列芯片检测IncRNA与mRNAfc正常组与感染组的表达水平。通过热图、散点图分析差异表达的IncRNA和mRNAfi过cis/trans预测靶基因对差异的IncRNA进行靶基因的预测并进行GOKEGC

3、W集分析，将相应的基因根据功能的不同归类,将有差异的pathway进行富集,从而将相应的基因进行注释及分类,找到实验条件下显著性差异变化的生物学调控通路并确定研究的IncRNA及相应靶基因。通过生物信息学方法对IncRNA进行定位分析并确定核质位置。通过实时定量PCRT大样本验证IncRNA及靶基因的表达。免疫组化、免疫荧光检测感染弓形虫慢性感染脑组织中蛋白的变化。利用CCK-8流式细胞术、克隆形成、TUNE学实验在细胞水平上研究IncRNA的功能。通过才建shRNAF口过表达体系，研究IncRNA的表达变化对靶基因表达的影响并通过Westernblot检测蛋白变化。此外,我们通过RNAPul

4、ldown实验将与IncRNA相关的蛋白拉下来，并通过质谱分析，鉴定蛋白的种类，进一步揭示IncRNA调控下游靶基因的机制。芯片数据显示，感染弓形虫的小鼠脑组织中IncRNA和mRNA勺表达发生了较大的变化，通过筛选发现lncRNA11496在弓形虫慢性感染脑组织中的表达差异变化较大。通过GOKEGCW集分析，对IncRNA的靶基因和mRNAJ行基因注释及分类，发现lncRNA11496和宿主精神行为的改变密切相关；通过cis/trans预测了lncRNA11496的基因，确定lncRNA11496靶基因是Mef2c。我们证实lncRNA11496定位于细胞核内。同时，我们通过qPCR佥证发现

5、,lncRNA11496和Mef2c都是下调的。我们通过荧光定量PCR佥测了干扰及过表达lncRNA11496以后，检测相应靶基因Mef2c的表达变化，结果显示，lncRNA11496正向调控Mef2c的表达。同时，我们通过Westernblot检测了蛋白水平上的表达,进一步验证了这一结果。在体外培养的神经细胞中，我们转染shRNAF扰lncRNA11496及过表达lncRNA11496，通过CCK-8和克隆形成实验发现，干扰了lncRNA11496以后，细胞增殖变得缓慢,而过表达lncRNA11496以后,发现细胞增殖变快。我们进一步通过流式细胞术检测了细胞周期的变化，发现lncRNA的变化

6、影响了细胞GtG2和S期的占比,进而影响了细胞的增殖情况。此外,我们还发现,干扰lncRNA11496的表达能够促进细胞凋亡,而lncRNA11496表达增加能够抑制细胞凋亡。通过RNApulldown及质谱分析,我们发现lncRNA11496是通过结合HDAC来影响Mef2c的表达，进而调控神经细胞的增殖分化和凋亡。综上所述，本研究通过微阵列芯片技术检测了感染n型弓形虫后，小鼠脑内IncRNA和mRNA勺差异表达。发现lncRNA11496差异表达显著并与精神行为密切相关，并且证明lncRNA11496是通过结合HDAC来调控其靶基因Mef2c的表达，进而影响小胶质细胞的增殖、周期及凋亡。进一步I阐明了IncRNA在弓形虫慢性感染小鼠脑中的作用和调控机制，对弓形虫对宿主神经系统侵害的防治会开辟一个崭新的方向。