酶活性检测

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1、分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量 或产物的增加量。几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。如还原型辅酶I (NADH2)和辅 酶II(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该 法测定。该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的 极大的方便。酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。酶的积极作用我们要加强， 在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加 热等方法将酶灭活，消除其不利影响。为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要

2、的。而紫外-可见分光光度 法是研究酶性质的重要方法之一。下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。紫外-可见分光光度法测定酶活：1. B 半乳糖苷酶B 半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而 提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同 时还可用于生产低聚半乳糖。【酶活测定】以ONPG为底物测定半乳糖苷酶活力。【酶活定义】以ONPG为底物，37C保温酶解，每分钟释放Ipmol/L邻硝基酚的酶量， 定义为 1 个酶活力单位。2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SO

3、D)是一种十分重要的生物体防止氧 化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。SOD广泛存在于各类 生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次发现了 SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗 缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将 其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。【酶活测定】在25C 4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待 测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径Ic

4、m的比色杯，在 325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma公司的SOD标准品，对所测样品SOD 活性进行校正。【酶活定义】在Iml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一 个酶活单位， 即 325nm 0.035OD/min 为一个酶活单位。3. 多酚氧化酶多酚氧化酶(PPO )是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶，其作用 机理在于铜的氧化-还原作用。大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后，具有单宁性质， 易和蛋白质起交联作用而沉淀出来，进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大 麦中部分PPO以“潜伏”状态存在，在浸麦过程中，可通过去除一些

5、酶抑制剂、蛋白酶作用 或其他的一些方式使其活性在浸麦过程中提高。在大麦发芽过程中，PPO的活力较高，影 响着麦芽的质量。因此，在制麦过程中应该降低PPO活性。【酶活测定】O.ImL酶液与lmL 0.1 mol/L邻苯二酚（用pH 8.4柠檬酸-磷酸缓冲液配 制）80oC反应3min,用2mL 20%TCA终止反应，于波长450nm处用分光光度计测定吸收 值。【酶活定义】上述条件下，将每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活力单位。4. 葡萄糖氧化酶 上世纪60年代以前，葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工业，除去葡萄糖，防止发生Maillard反应，稳定产品质量，延长保质期。80年代末，又陆续开发了去除

6、啤酒溶解氧和 瓶颈氧改善风味延长保质期、果汁果酒除氧护色稳定质量、面粉品质改善、海产品和肉类保 鲜、饲料添加去氧平衡畜禽胃肠代谢等用途，并建立了葡萄糖氧化酶专业生产车间。【酶活测定】采用-联（二）茴香胺分光光度法。在有氧存在条件下，葡萄糖氧化酶催化 葡萄糖脱氢产生H2O2,在过氧化物酶（POD）作用下，氧供体即邻一联（二）茴香胺（DH2）被氧 化成棕色产物。于 436nm 处测量吸光率的变化，即可换算为葡萄糖氧化酶的活性。【酶活定义】一个酶活性单位定义为在26C下每分催化释放一微克分子H2O2所需的 酶量。5. 果胶酶 果胶酶可以改善葡萄酒的色泽、增加酒香，并提高葡萄酒出汁率等，对提高红葡萄酒

7、的品质有重要作用。【酶活测定】向具塞试管中加入1.8mL 0.30%聚半乳糖醛酸溶液（用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液配制，调节pH 10.0），于55C水浴下保温5 min,然后加入一 定稀释倍数的酶液0.2 mL反应15 min,加入DNS试剂1.5 mL，混匀,在沸水中加热10min, 立即用自来水冷却，再加入21.5 mL蒸馏水，混匀，于分光光度计上520 nm测定吸光度。 空白用煮沸失活的酶液代替。【酶活定义】在上述试验条件下，以每分钟分解底物产生Ipmol半乳糖醛酸所需的酶 量为 1 个酶活力单位。6. 胰a-淀粉酶【酶活测定】用移液管将0.5 mL酶溶液

8、移入试管，并在水浴中调温至25C。加0.5 mL 已同样预热到25C的 1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS显色剂。置试管于沸水中5 min, 冷却后用10 mL蒸馏水稀释。用分光光度计于540 nm处以空白作对照测定吸光度。以0.5 mL磷酸盐缓冲液代替酶液测定空白值。7. 植酸酶【酶活测定】 以植酸钠为底物，采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l 的植酸钠（酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸钠缓冲液配制）1.0 ml, 37 oC 预热5 min后，准确加入适当稀释的酶液0.5 ml（对照组先加反应终止液），37 oC水浴反应 30min

9、后，再加入4 ml反应终止液（现用现配）冷却至室温，在415 nm处测定0D值，利用 无机磷标准曲线计算出酶活。【酶活定义】在37C,每分钟从1 mmol/l植酸钠溶液中（用pH值5.5的醋酸-醋酸钠 缓冲液配制）释放出1 nmol无机磷所需要的酶量为一个酶活单位。8. 羧甲基纤维素酶【酶活测定】在0.5mL适当稀释的酶液中加入质量分数为0.625%的羧甲基纤维素钠 溶液，于50C水浴中保温30min,加2.0 mL质量分数为10%的NaOH溶液终止反应，再 加入2.5mLDNS试剂，于沸水浴中煮沸15min,冷却，在550 nm波长处比色，要求光密 度读数尽可能在标准曲线的 0. 5 mg

10、葡萄糖处。每次测定均设立空白对照，对照管先加入 0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL质量分数为10%的NaOH溶液将酶灭活，再依次加入质量 分数为0.625%的底物2. 0 mL，与待测管一起保温，加入DNS，煮沸、冷却、稀释比色、 与标准曲线对照。【酶活定义】在上述条件下，每30min产生0.5mg还原糖为1个Cx活力单位，即每 1 h产生1.0mg还原糖为1个Cx活力单位。9. 木聚糖酶木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖（阿拉伯木聚糖），使其成为水溶性的，水解率达65%。 面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能提高面团的持水性和机械强度，使面团具有更好的持气 能力和操作耐力，进而提高馒头和面包的品质。

11、【酶活测定】以木聚糖为底物，用DNS法测定还原糖的生成量。取稀释酶液0.1ml, 加1%木聚糖液0.9ml,置50C水浴保温30min后，加DNS 2ml于沸水浴中显色3min,用 自来水冷却后，加蒸馏水定容25ml，测O.D值。【酶活定义】每毫升酶液每分钟水解木聚糖生成Ipmol木糖所相当的酶量。10. 蛋白酶【测定原理】中性蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨 基酸,在碱性条件下,将福林试剂还原,生成钼蓝与钨蓝,其颜色深浅与酚基氨基酸含量成正 比。通过在660 nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以 此代表蛋白酶的总酶活力。【酶活测定

12、】取3支试管（一支空白管,两支样品管）,分别向3支试管中准确加入稀释好 的待测酶液1.0 mL，将3支试管放入40C水浴中预热5 min,同时将测定底物（1%酪素）置同 一温度水浴中预热5 min。分别向两只样品管中加入1%酪素溶液1.0 mL,准确计时，反应10 min取出。迅速准确向两只样品管加入0.4 mol/L三氯乙酸2mL,于空白管中加入0.4 mol/L 三氯乙酸2 mL和1.0 mL 1%酪素溶液,摇匀。3支试管中反应液用滤纸过滤。另取3支试管, 分别吸取上述相应滤出液1.0 mL,0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL和稀福林试剂1.0 mL,摇匀, 置40C水浴中放置20

13、mi n（显色），取出，迅速冷却置室温。以空白管调仪器零点，在分光光度 计波长 660 nm 处分别测两支样品管吸光度,取平均值。通过查标准曲线求出生成酪氨酸的 含量。11. a-淀粉酶a-淀粉酶是第一个应用于面包制作的微生物酶，它取代了麦芽是由于麦芽中的淀粉酶 含量不稳定而且含有蛋白水解酶。【酶活测定】在10 mL 试管中依次加入0. 5%可溶性淀粉溶液1 mL , pH 4. 2的磷酸 氢二钠-柠檬酸缓冲液2. 5 mL, 40 C预热10 min。然后加入多倍稀释的0. 5 mL酶液,40 C 保温5 min后，加入0. 1 mol/L H2 S04 1 mL终止反应。再取2 mL反应液

14、与0. 5% KI - 12溶 液0. 5 mL显色，测定OD620。与淀粉梯度标准曲线对照得反应液淀粉浓度后,计算酶活力。【酶活定义】在pH 4. 2、温度40 C下,5 min水解可溶性淀粉1 mg所需的酶量为一 个酶活力单位 。12. 脂肪酶利用脂肪酶作用后释放出的链较短的脂肪酸，增加和改进食品的风味和香味;利用脂肪 酶催化的醇解和酯化反应来生产各种香精酯，作调料剂;用有专一性的微生物脂肪酶提高食 用油营养价值和增加食用油的花色品种，制备代可可酯等高档油脂;另外，脂肪酶还可以用 于酒类的去浊除渣、改善面包质量、改善蛋白的发泡等方面。【酶活定义】在40C、pH 7.5,以每分钟从橄榄油中释

15、放lpmol脂肪酸的酶量定义为 一个酶活力单位。13. 漆酶【酶活测定】3.0mL反应液中含20 mmol/LABTS 0.7mL,酶液0.lmL和25 mmol/L 琥珀酸缓冲液(pH4.5),在25C下反应2min后立即用冰浴终止反应，测定436nm处吸光度 的增量。14. 木质素过氧化物酶【酶活测定】30C条件下反应体系中含酶液，浓度为0.2mol/L,且pH值为2.4的酒 石酸缓冲液及浓度为0.008mol/L的黎芦醇各lmL,加人浓度为0.016mol/L的H2O2 lmL启 动反应，测定反应最初4min内在310nm处的吸光度，以灭过酶活的酶液作对照。15. 锰过氧化物酶【酶活测定

16、】室温下反应体系中含有50mmol/L pH4.5的乳酸钠缓冲液3.4mL,1.6mmol/L 的 MnSO4 溶液 0.lrnL,酶液 0.4rnL,加人 1.6 mmol/L 的 H2O2 0.lmL 启动反应。 测定反应最初 4min 内在 240nm 处的吸光度。【酶活定义】每分钟使gmol的Mn2+转化成Mn3+所需要的酶量为一个酶活单位。 仪器配置Thermo公司Genesys系列、Helios系列和Evolution系列紫外-可见分光光度计均可 进行食品酶分析。EnzLab软件是Thermo公司研制的专业食品酶分析软件，具有智能提示 功能,可以一步步引导操作员完成酶活测定。即使不是酶分析专家,也能获得准确、可靠的 数据。而且该软件支持手动输入模式,即使实验室使用的是其它品牌的分光光度计,也能享 受EnzLab软件带来的智能和便捷酶活性的测