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1、华中农业大学2011届本科毕业论文本科毕业论文(设计)题 目基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建Construction of Blu-ray Induced Expression System in sf9 insect Cells姓 名蔡泽蕲 学 号2011304200107 学 院生命科学技术学院专业班级生科1101指导教师徐富强 职 称研究员中国武汉二一五 年 六 月华中农业大学学士学位论文基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建Construction of Blu-ray InducedExpression System in sf9 insect Cells学生姓名:蔡泽
2、蕲学生学号:2011304200107学生专业:生物学基地班指导教师:徐富强 教 授指导小组:吴 阳 博后华中农业大学生命科学技术学院二一五年六月目录摘 要IAbstractIII缩略词表IV1 前言11.1 诱导型启动子11.1.1天然诱导型启动子11.1.2人工诱导型启动子11.1.3 光诱导启动子21.2 VP-EL222转录激活系统31.3 VP-EL222系统在293T细胞中的表现41.4 pMIB/V5-His载体51.5实验背景和目的52.材料与方法62.1 实验材料62.1.1 材料与试剂62.1.2部分主要试剂的配制62.2实验方法72.2.1 sf9细胞的传代培养72.2.
3、2 分子克隆基本策略72.2.3 通用PCR体系及程序82.2.3 酶切体系和方法及胶回收试剂盒的使用82.2.4连接体系及方法92.2.5 转化用 E.coli DH5 感受态的制备92.2.6 转化的步骤92.2.7 质粒抽提试剂盒的使用102.2.8质粒DNA的非柱回收简单纯化步骤102.3载体构建流程102.4转染113结果与分析123.1载体鉴定图123.2转染结果123.3结果分析13参考文献15致谢17摘 要光诱导表达系统作为人工诱导表达系统中最璀璨的一员，正受到越来越重要的关注。光作为诱导因子控制基因表达比其它化学因子具有无可比拟的优势，如对时间和空间上的精确把握。尽管如此，当
4、前主要的光控表达系统仍有很多弱点限制着它的应用，比如：蛋白本身的毒性、狭窄的调控范围以及反应缓慢的激活和去激活作用，相比传统的化学诱导表达系统没有压倒性优势。在我们这里将展示一个新的光控表达系统，它没有前述三大缺点，且已被证明广泛的适用性。通过这个系统，我们在多种哺乳动物细胞中测试了光控转录作用。这一方法对在时空上精确控制基因表达是一个强大的工具。本文将讲述这个新的光控表达系统在sf9昆虫细胞蛋白表达中的应用。Sf9昆虫细胞即草地贪夜蛾细胞。Sf9细胞是由G.E. Smith 和 C.L. Cherry 在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一个克隆。IPLB-SF 21 AE是
5、1977年由Vaughn等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。sf9细胞属于半贴壁型细胞系，可以进行悬浮培养，也可以进行贴壁培养，在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点。Sf9昆虫细胞是杆状病毒表达系统的平台。杆状病毒表达系统(baculovirus expression system)是近年来应用较多的真核表达系统，它可以在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。杆状病毒是一类以昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，对人畜无害。目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒 (AcMNPV)。而我们用来构建的这个光控表达系统所使用的载体p
6、MIB/v5-his中的OpIE1和OpIE2正是一个杆状病毒的早期启动子，其中后者是比前者更强的启动子。该杆状病毒是黄杉毒蛾核多角体病毒（OpMNPV），它的天然宿主是道格拉斯冷杉毒蛾。尽管如此，这两个启动子仍然能够在sf9细胞、sf21、LD652Y等多种昆虫细胞中驱动基因表达。杆状病毒早期启动子可以在没有病毒因素的情况下利用细胞转录机制驱动基因表达。因此从某种程度上说，杆状病毒表达载体所具有的优点，我们使用的pMIB载体也同样具有。如：1）表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键； 2） 翻译后可进行修饰加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信号肽切割等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；
7、3） 与其他I华中农业大学2015届本科毕业论文真核表达系统相比， 杆状病毒表达系统可以高效表达外源基因，表达量最高可达被感染 昆虫细胞总蛋白量的5 0 ；4）可以容纳大片段外源基因。该系统当前已有实验证明在293细胞中发挥作用，且效果良好，我们计划把它引入到sf9昆虫细胞中。我们的主要工作是构建承载该系统的质粒，然后转染sf9昆虫细胞，获得报告基因的表达情况。在引入这个系统之前我们需要对其进行定性测试，采取的方法是用红色荧光蛋白基因mCherry作为报告基因，通过mCherry的表达情况大致了解这个光控系统的运作行为。而本文就主要讲述对这个系统的探索与测试所做的努力。这个系统作为人工控制基因
8、表达系统家族中的最有潜力的系统之一，具有足够的优势，有望在生命科学各个领域发挥作用，这里对它的应用只是一个很小的方面，它本身的应用并不仅限于昆虫细胞，对很多脊椎动物细胞都适用。此次在昆虫细胞中对该系统的实践则是首次。关键词：杆状病毒表达载体、光控表达系统、昆虫细胞。AbstractAs the most bright one of the artificial induced expression system, optogenetic gene expression system is being more and more popular. Light as induced factor
9、to control gene expression has the incomparable advantages over other chemical factor, such as the accurate control of time and space. In spite of this, the current main optogenetic gene expression system still has many weaknesses that limit its application, such as: the toxicity of the protein itse
10、lf, narrow scope of regulation, and the slow activation and deactivation, so that it is not overwhelming compared with the traditional chemical inducing expression system . Here we will show a new optogenetic gene expression system, which does not has the big three shortcomings, and has shown a wide
11、 range of applicability. With this system, we have tested in a variety of mammalian cells to confirm whether it can drive transcription of the target gene. The method for precise control of gene expression in time and space is a powerful tool. This paper will talk about the application of this new o
12、ptogenetic gene expression system in sf9 insect cell . Sf9 insect cells is Spodoptera frugiperda cell . Sf9 cells is made up of G.E. Smith and C.L. Cherry from cell lines IPLB in 1983 - SF, a clone of the 21st AE to come. IPLB - SF, 21st AE is 1977 by Vaughn from ovarian tissue of meadow moth pupa.
13、Sf9 cells belong to half adherent cell lines, which can suspension culture, and also can undertake adherent culture.Its application in protein expression and the preparation and purification has many advantages over others. Sf9 insect cells is a platform baculovirus expression system . Baculovirus e
14、xpression system is more and more widely applied in eukaryotic expression system in recent years, which can carry a variety of foreign genes need to express in insect cells, including fungi, plants, bacteria, virus genes. Baculovirus is double-stranded DNA virus,the natural reservoir of which is ins
15、ect cell.Since has a high degree of species specificity, it not infected vertebrates, positively harmless to human and animal. The present study is more alfalfa crazing armyworm nuclear polygonal body virus (AcMNPV). OpIE1 and OpIE2, two promoters of the vector pMIB/v5 - His which we used to construct the optogenetic gene expression system are early promoter of a baculovirus, and former promoter is more stronger. The baculovirus is Orgyia pseudotsugata multicaps
