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1、液相色谱使用及注意事项(注：使用HPLC前请充分理解本protocol,首次使用请在熟悉HPLC的人员指导下进行)：高效液相色谱仪(HPLC)的组成和各个部件的功能简介：HPLC由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、信号采集等五大部分组成。分析前，检查是否是合适的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用液相专用微量平头进样器进样，流动相把样品带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，信号釆集输出至电脑经过处理形成色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高
2、低的依据。高压输液系统：高压输液泵是HPLC关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续稳定送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。进样系统：包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱中进行分离。分离系统：包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成，其内径为26nmi,柱长为1050cm,我们柱温箱可以使用小于300mm色谱柱，内部充满微粒固定相，柱温根据文献设定。检测系统：荧光检测器和紫外检测器荧光检测器(FluorescenceDetector,faj称FLD)是HPLC常用的一种检测器。用紫外线照射色谱饰分，当试样组分具有
3、荧光性能时，即可检出。选择性高，只对荧光物质有响应;灵敏度也高，适合于多环芳烧(PAHs)及各种荧光物质的痕量分析。每种物质对应特定的激发波长和发射波长，根据参考文献进行所测样品的两个波长设置。紫外检测器(UlmmoletDetecs)是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器，其工作原理是Lamben-Beer定律，即当一朿单色光透过流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比。物理上测得物质的透光率，然后取负对数得到吸收度。大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外或可见光吸收基团，因而有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UVD既有较高的灵敏度，也有很广
4、泛的应用范围，是液相色谱中应用最广泛的检测器。每种物质对应特定的吸收波长，根据参考文献进行所测样品的两个波长设置。信号采集：液相色谱工作站对检测器信号进行釆集，集成处理数据，形成色谱图。二：操作规程方法建立数据处理操作过程：在开机之前，根据所做样品的方法要求，准备好所用流动相，标样及样品。流动相0.22pm膜抽滤后超声脱气30分钟。A、B两相中，则A管道连接蓝盖瓶的水相，B管道连接蓝盖瓶的有机相。确保每天用重新超声和超滤过的水和有机相。所有样品过膜（0.22或0.45pm滤膜）后使用。开机步骤：依次打开电脑一泵柱温箱一检测器一打开LCsolution-点击“1分析”听见“滴滴”两声待自检通过一
5、打开“文件”中“方法文件夹”调出方法，平衡压力30分钟左右即可进样。进样步骤：打开左栏框内“单次运行”一载入“方法文件”和“数据文件”后点击“确定”一进样阀上扳、进样打针、下扳、取针，自动开始走样。关机步骤：试验结束后用水相（有盐离子时必须用水冲洗干净时间最少1小时）或有机溶剂冲洗管道（半小时以上），冲洗结束后分两种情况：1, 第二天继续做样：流速调小约O.lnil/min（确保AB两相不能走空，蓝盖瓶内溶液足够）一关闭检测器光源一关闭柱温箱（第二天做实验依次打开柱温箱和检测器光源）2, 长期不用：根据色谱柱保存要求进行封柱（如PAHs专用柱：用100%乙睛1.0ml/min冲洗1个小时左右）
6、一关掉检测器光源一关掉仪器一关软件（“滴”一声）一关泵一关电脑。方法建立：建立色谱操作方法：建立色谱操作方法（参数设置：流动相AB比例，流速，柱温箱，波长的设置）。注意保存为自己命名的Method,勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；标准曲线的建立：配置一系列标准浓度梯度的标液，一般釆取逐级稀释的方法（5-8个点）。具体步骤参照仪器使用说明P18-P24页。数据处理：“再解析”里读取最终浓度，眷抄到自己的记录本上。三：HPLC操作注意事项1,排气泡如何排出Teflon管道内气泡：排空操作：打开LC-20AT泵排空阀（逆时针90度以上）,按Piuge键，泵开始排空运行。检查流动相入口Teflon管
7、路没有气泡后，Pmge灯不再闪烁时，关闭LC-20AT泵排空阀。如何排出进样针内气泡：使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用多次清洗进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液润洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡（进样针吸取样品之后，颠倒针管，气泡会往上跑，猛推一些样品出去，气泡即可随之排出）。2流动相：流动相应选用色谱纯试剂、高纯水，酸碱液及缓冲液需经0.22Mm膜过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和有机相膜的使用范围；使用泵时，A、B两相中，则A管道连接蓝盖瓶的水相，B管道连接蓝盖瓶的有机相。确保每天用重新超声和超滤过的水和有机相。3色谱柱：使用前仔细阅读色谱柱附
8、带的说明书，注意适用范围，如pH值、流动相类型等;使用符合要求的流动相；使用保护柱；如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5%甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。色谱柱在不使用时，根据柱子特性和使用要求，用不同溶剂封存。比如，PAH专用柱用乙惰冲洗封柱，取下后紧密封闭两端保存；不要高压冲洗柱子；一般用流速l.Onil/min冲洗，压力约7Mpao4样品：进样之前必须用0.22pm滤膜过滤，确保样品中不含固体颗粒；一般尽量用流动相制备样品液。比如测PAHs时，流动相用的是水和己腊，进样的溶剂也应为水或己月青。手动进样时，进样量一般大于40卩1,并且不要含气泡，针头外壁要擦净
9、。5压力操作过程若发现压力很小，（一般是在6-20）则可能管件连接有漏，注意检查。当出现错误警告（各组件指示灯均为红色），一般为漏液，其中一个感应器中己有溶剂,漏液故障排除后，擦干，点击Online操作界面中的Iiistnunent/SystemOff,然后再点击操作界面中的Iiistniment/SvstemOil即可。操作过程若发现压力非常高，则可能管路已堵，应先卸下色谱柱，然后用分段排除法检查，确定何处堵塞后解决。若是保护柱或色谱柱堵塞，可用小流量流动相或以小流量异丙醇冲洗，还可采用小流量反冲的办法（新柱不提倡），若还是无法通畅，则需换柱；运行过程中自动停泵，可能为压力超过上限或流动相用完；6切记关灯超过2小时以上不做实验时，从工作站将检测器灯关掉（灯的寿命有限）。7使用登记：使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时报告，不要擅自拆卸仪器。
