重组人胰岛素 信息资料

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1、CN1177928A 中文发明名称一生产人胰岛素出】主n 申请号CN94195231申请日1994.12.29公开（公告）号CN1177928A公开（公告）日1998.04.01IPC分类号A61K38/28; C12N15/17申请（专利权）人生物技术通用公司；发明人JR 哈特曼;S口德罗维茨;M 戈雷基；优先权号优先权日申请人地址美国新泽西州；摘要支持框选翻译简体中文- 英文 英文- 简体中文其他语种提供了改进且有效的通过折叠胰岛素原杂交多肽来生产重组人胰岛素的方法。摘要附图发明名称-Generation of human insulin出】主n 申请号CN94195231申请日1994.

2、12.29公开（公告）号CN1177928A公开（公告）日1998.04.01IPC分类号A61K38/28; C12N15/17; C12N15/16申请(专利权)人BIO TECHNOLOGY GENERAL CORP;发明人HARTMAN J R;MENDELOVITZ S;GORECKI M;优先权号CN94195231优先权日1994.12.29摘要支持框选翻译简体中文-英文英文-简体中文其他语种Abstract：An improved and efficient process for the production of recombinant human insulin by f

3、olding of a proinsulin hybrid polypeptide is provided.摘要附图1. 生产胰岛素的方法包括：(a) 在允许形成正确二硫键的条件下，折叠含胰岛素原的杂种多肽；(b) 使折叠的、二硫键键合的杂种多肽经酶促裂解以产生胰岛素；(c) 纯化胰岛素。2. 根据权利要求1的方法，其中步骤(a)还包括在约pH8.5- 12.0,约4-37将杂种多肽保温约 1-30小时。3. 根据权利要求2的方法，其中在存在抗坏血酸的条件下进行保温。4. 根据权利要求2的方法，其中pH为11.0-11.25。5. 根据权利要求3的方法，其中pH为11.0-11.25。6. 根

4、据权利要求3的方法，其中在折叠混合物中，抗坏血酸的浓度为每摩尔SH基约2摩尔 抗坏血酸。7. 根据权利要求2的方法，其中所述保温时间为约5小时。8. 根据权利要求3的方法，其中所述保温时间为约5小时。9. 根据权利要求1的方法，其中步骤(b)还包括：(I)将pH调到约8.8-9.0；和(ii)在16-37用胰蛋白酶和羧肽酶B裂解杂种多肽30分钟-16小时。10. 根据权利要求1的方法，其中步骤(c)还包括用DEAE- Sepharose层析和RP-HPLC纯化。11. 根据权利要求1的方法，其中步骤(c)还包括用超滤和CM -Sepharose层析纯化。12. 根据权利要求1的方法，其中步骤(

5、c)还包括用DEAE- Sepharose层析和苯基-Sepharose层 析。13. 根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69361的质粒pDBAST-LAT表达胰岛素原 杂种多肽。14. 根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69363的质粒p入BAST-LAT表达胰岛素原 杂种多肽。15. 根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69362的质粒pBAST-LAT表达胰岛素原杂 种多肽。16. 根据权利要求1的方法，其中通过处理含编码杂种多肽之DNA的细菌细胞，以便DNA 指导所述多肽的表达，从而得到步骤(a)的杂种多肽。17. 根据权利要求16的方法，其中从所述细胞中

6、回收杂种多肽。18. 根据权利要求16的方法，其中所述处理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的条件下发酵。19. 根据权利要求17的方法，其中所述回收包括：(I)破坏所述细菌细胞的细胞壁或其片段以产生溶胞产物；(ii) 通过离心从溶胞产物中分离细胞内沉淀物；和(iii) 增溶所述沉淀物。20. 含有胰岛素原和与所述胰岛素原的N-末端相连的前导肽的多肽，其中所述多肽被折叠并 含有正确的二硫键。21. 根据权利要求20的多肽，其中所述前导肽衍生于CuZnSOD的N-末端。22. 根据权利要求21的多肽，其中所述前导肽含有62个氨基酸，其前为氨基酸Met，其后 为Arg残基。23. 根据权利要求20的多肽

7、，其中所述胰岛素原含有通过单Arg残基与胰岛素A链共价相连 的胰岛素B链。24. 根据权利要求20的多肽，其中所述胰岛素原含有通过二肽Lys-Arg残基与胰岛素A链共 价相连的胰岛素B链。25. 根据权利要求20的多肽，其中前导肽的Cys残基已经被Ser残基所取代。说明书生产人胰岛素这是美国系列申请08/175298，1993年12月29日申请的接续申请。发明背景在本发明说明书中，用括号内的阿拉伯数字列出了各种文献。在说明书后，权利要求前可以 找到这些参考文献的所有引述。将这些文献公开的所有内容均引入本说明书作为参考以便更 全面地描述本发明所涉及的现有技术的状态。胰岛素是控制葡萄糖代谢所必需的

8、多肽激素，每天施用给患糖尿病的患者，糖尿病是胰岛素 供应不足而引起的代谢紊乱。体内，首先将该激素合成成长前体分子，随后加工成由A和B链组成的其生物活性形式。更详细地说，在内分泌胰腺的8细胞内，将前原胰岛素的基因转录成mRNA前体，然后剪 接生产成熟mRNA。将所述mRNA翻译成前原胰岛素(NH2-前区-B链-C肽-A链-COOH)，接着 再加工成胰岛素原并最终加工成胰岛素。该过程的第一步就是蛋白水解除去前区，该区是通 过内质网的微粒体膜来转移新链的疏水信号序列。在人前原胰岛素中，前区的长度是24个 氨基酸。在胰岛素原中，将变成成熟胰岛素的多肽链的两个区，B-和A链通过C肽(或C-链)彼此相连，

9、 所述C肽在N和C末端含有两对碱性氨基酸。在大多数C肽中，这些配对是Arg-Arg和Lys-Arg。 人C肽，包括两个侧对的碱性氨基酸，含有35个氨基酸。C肽与所述多肽的两个部分相连 以便有助于在B和A片段之间形成二硫键。因此，C肽的作用很大程度上不依赖其结构。事实上，用较短的合成桥键代替仍能适当地折叠胰岛素原分子(1，2)。胰岛素原折叠，同时发生两个链间二硫键和一个A链二硫键的氧化。在成熟化的最后阶段， 蛋白水解酶在碱性氨基酸处裂解以释放C肽并形成成熟胰岛素(3)。在人胰岛素中，A链有 21个氨基酸，B链有30个氨基酸。世界上每年胰岛素的需求超过数吨，而且严重供不应求。传统上，胰岛素是从有限

10、的动物源 中生产的，主要是牛和猪胰腺制品，它们不同于人胰岛素，因此会引发有害的免疫反应。 在六十年代完成的研究表明，可以体外生产胰岛素。通过用其S-磺化形式(4)将A和B链结 合或通过自发再氧化还原的胰岛素原(5)来合成胰岛素。后一种方法由于在氧化混合物中蛋 白质浓度很低，不能用于大规模生产胰岛素。在用胰蛋白酶和羧肽酶B处理后(6)，可以回 收胰岛素。最近半合成和生物合成的(重组)人胰岛素也可以得到。半合成的人胰岛素是通过胰蛋白酶催 化B链30位的Ala换成Thr(是猪胰岛素和人胰岛素之间的唯一不同)而从猪胰岛素生产的。 在大肠杆菌或酵母中生产的重组人胰岛素最终将取代所有其它生产途径。现在通过

11、两种途径制备半合成重组人胰岛素：在大肠杆菌中分开生产A和B链，然后将其 结合在一起(7, 8)，或酶促转变在大肠杆菌(1，8)或酵母(2, 9冲表达的胰岛素原等多肽。在大多数情况下，胰岛素原是作为杂种蛋白质而生产的，以细胞内沉淀蛋白质的形式积累。 正常纯化所述杂交物，然后用CNBr裂解以释放胰岛素原多肽。后者再通过氧化亚硫酸水解 (sulfitolysis)修饰得到胰岛素原S-磺酸盐。然后在还原条件下纯化并折叠胰岛素原S-磺酸盐， 得到胰岛素原(8)。通过胰蛋白酶和羧肽酶B(6)的联合作用将胰岛素原转变成胰岛素。专利公开EP195691(Novo Nordisk A/B)描述了分子式为B- L

12、ys-Arg-A的胰岛素原以及其用于在 酵母中制备胰岛素的用途。专利公开EP196056 B1(Chiron Corp.，)描述了用酵母生产的hSOD-胰岛素原蛋白质。在折叠 前，使hSOD-胰岛素原蛋白质经漠化氰裂解和亚硫酸水解。Hoechst在EPO 379162中描述了可以将胰岛素前体的错重组体“(即，有不正确或部分不 正确分子间二硫键的重组胰岛素产物)不通过亚硫酸水解，而是在有机氧化还原系统的存在 的条件下，在含水介质中通过将错重组体与过量硫醇反应而转变成正确的胰岛素产物。在氨 基酸或肽基从融合多肽裂解后(化学或酶促)(发生在宿主细胞溶解后)进行源(original)亚硫酸 水解(su

13、lfitolysis)步骤，因为然后要将胰岛素前体的6个半胱氨酸转变成其S-磺酸盐。在随后 的复性步骤中，通过形成三个正确的二硫键而从所述胰岛素原S-磺酸盐生产天然胰岛素原。 在该复性步骤，产生了所谓“错重组体”。Hoechst在PCT WO 91/03550中还公开了制备含所需蛋白质(如胰岛素原)和“平衡组分”的 方法。亚硫酸水解在折叠前完成，而在折叠后，与胰岛素原的C-链同时裂解掉“平衡组分”。另外，Hoechst在EP 347781 B1中描述了 “小胰岛素原”(B- Arg-A)和其用于致病单-Arg胰岛 素和胰岛素的用途。他们还描述了含有B-Arg-A和“平衡组分”的融合蛋白质。在折

14、叠多肽 前，用漠化氰裂解“平衡组分”并完成亚硫酸水解。本发明公开了用改进并有效的方法生产重组人胰岛素。在大肠杆菌中合成含有前导序列的重 组胰岛素原杂种多肽。部分纯化后，在可以进行之前折叠的条件下，将其折叠，但仍连接着 前导肽。然后通过用胰蛋白酶和羧肽酶B结合处理而产生有生物活性的人胰岛素，其中这些 酶同时裂解掉了前导肽和C链。因此生产的纯化人胰岛素与天然产生的人胰岛素相同。在杂种多肽的CNBr裂解和用于保护丰富SH基团的亚硫酸水解中所涉及的有害和麻烦的过 程在所述新方法中除去了，因为可以将完整的胰岛素原杂种多肽有效折叠成其天然结构，甚 至是在存在前导肽和未保护的半胱氨酸的情况下。通过酶促裂解释

15、放活性重组人胰岛素，然 后将其纯化。附图的简要描述在附图3-5中所列三个质粒的限制图谱中，并未鉴定出在这些质粒上的所有限制位点。但是， 列出了完全理解本发明所必需的那些限制位点。图1：通过酶促裂解表达质粒pBAST-R而产生的折叠的、二硫键结合的胰岛素原杂种多肽， 从而得到人胰岛素。只表明了部分SOD前导序列。图2：通过酶促裂解表达质粒pBAST-LAT或质粒p入BAST-LAT而产生的折叠的、二硫键结合 的胰岛素原杂种多肽，从而得到人胰岛素。只表明了部分SOD前导序列。图3：质粒pBAST-R的结构，编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒，保藏号为ATCC 69362。图4：质粒pDBAST-LAT的结构，编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒，保藏号为ATCC 69361。 图5：质粒p入BAST-LAT的结构，编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒，保藏号为ATCC 69363。图6：用质粒pBAST-R表达的SOD-胰岛素原杂种多肽的氨基酸序列和相应的DNA核苷酸序 列。图7：用质粒pDBAST-LAT和p入BAST-LAT表达的SOD-胰岛素原杂种多肽的氨基酸序列和相 应的DNA核苷酸序列。图8：人胰岛素生产，来自用质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素