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1、雷帕霉素或二甲双胍联合PD-1单抗在三阴性乳腺癌中的抗肿瘤 作用研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症死亡的主要原因之 一,严重威胁着女性的生命健康。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中恶性程度最高的亚型，由于缺乏有效化疗方案及靶向药 物，治疗手段比较单一，因此寻找新的有效治疗方法对TNBC患者至关重要。近年来,针对 PD-Ll/PD-1(programmed death-ligand 1/programmed death-1) 的免疫检查点阻断疗法取得巨大成功，截至目前，部分PD-1或PD-L1阻断药物已 经被FDA批准用
2、于部分恶性肿瘤患者的治疗。乳腺癌患者中开展的PD-L1或PD-1 单克隆抗体治疗研究表明,TNBC患者可于PD-1/PD-L1阻断疗法中获益。但由于患者之间的个体差异以及肿瘤免疫逃逸机制不同等原因,PD1/PD-L1 阻断疗法的有效率较低，因此，提高癌症患者对于PD-1/PD-L1阻断疗法的反应性 引起越来越多的关注。最新的研究表明，部分靶向治疗除了具备直接杀伤肿瘤细 胞的作用,还可以使患者对免疫治疗敏感化。因此，靶向治疗和免疫治疗的联合应用不仅能达到两种治疗的相加效果，更 能发挥协同效应。PI3K/AKT/mTOR通路可以调控肿瘤表面PD-L1的表达，同时有 研究表明mTOR抑制剂雷帕霉素以
3、及靶向AMPK/mTOR的二甲双胍可以通过调节免 疫系统发挥抗癌作用。因此，我们认为PD-1抗体联合雷帕霉素或者二甲双胍是值得探讨的联合治 疗方式，本研究将验证其在TNBC中的治疗效果，并探讨协同作用的机制,为新的 TNBC治疗方式提供理论基础。研究目的1.评估mTOR抑制剂雷帕霉素及二甲双胍 对乳腺癌细胞PD-L1表达的影响。2.建立TNBC小鼠模型，评估PD-1抗体与雷帕霉素或者二甲双胍联合治疗 TNBC的效果，并初步探究其作用机制。实验方法1.通过分析TCGA数据库数据， 比较PD-L1 mRNA在TNBC组织与Non-TNBC组织中的表达情况;分析CCLE数据库 数据，比较TNBC与N
4、on-TNBC细胞系中PD-L1 mRNA表达情况。2.利用RT-qPCR及Western Blot(WB)检测乳腺癌细胞系中PD-L1的表达;WB 检测乳腺癌细胞系mTOR通路活化状态;筛选MDA-MB-231与4T1用于下一步实验， 利用流式细胞术检测细胞膜表面PD-L1表达。3.雷帕霉素处理MDA-MB-231与4T1 细胞系不同时间,WB检测pS6、S6、PD-L1蛋白变化;二甲双胍处理MDA-MB-231 细胞系 24h,检测 pS6、S6、pAMPK、AMPK、PD-L1 蛋白变化。4.构建小鼠乳腺癌移植瘤模型，分为对照组、施用雷帕霉素组、施用二甲双 胍组，用药三周，统计雷帕霉素或
5、二甲双胍在小鼠体内对肿瘤增殖及转移的影响， 评估雷帕霉素或二甲双胍的抗肿瘤效果。5.构建小鼠移植瘤模型,分为对照组、 雷帕霉素组、PD-1组、雷帕霉素联合PD-1组，用药三周，评估单药及联合用药对 肿瘤生长的影响。6.利用HE染色评估肿瘤细胞的形态学改变;免疫荧光及免疫组化检测小鼠 肿瘤组织的PD-L1、pS6、active casepase-3、CD3表达情况。7.构建小鼠移植 瘤模型，分为对照组、二甲双胍组、PD-1组、二甲双胍联合PD-1组，评估单药及 联合用药对肿瘤生长的影响。8.利用免疫荧光及免疫组化检测小鼠肿瘤的PD-L1、pS6、activecasepase-3、 CD3表达情况
6、。实验结果1.TNBC组织PD-L1 mRNA水平显著高于Non-TNBC组织， 差异有统计学意义。虽然没有统计学意义,TNBC细胞系PD-L1 mRNA整体表达高于Non-TNBC。2.体内外实验结果表明，雷帕霉素与二甲双胍无论在体外，还是体内，均能降低PD-L1表达，这种作用与mTOR通路的抑制有关。3.小鼠体内实验证明雷帕霉素与二甲双胍均能降低肿瘤瘤重，减少肺转移， 差异有统计学意义。4.小鼠体内实验显示,PD-1单抗、雷帕霉素、雷帕霉素联合 PD-1单抗均能显著抑制肿瘤生长，降低瘤重，联合用药较单药效果更加显著，差 异具有统计学意义;PD-1单抗、二甲双胍、二甲双胍联合PD-1单抗均能
7、显著抑 制肿瘤的生长，降低瘤重，联合用药较单用二甲双胍的抗肿瘤作用更加显著，差异 有统计学意义;虽然联合用药组瘤重低于PD-1单抗组，但差异没有统计学意义。5.雷帕霉素与PD-1组联合用药HE染色显示雷帕霉素组肿瘤大片坏死,PD-1 组肿瘤坏死较轻，但肿瘤细胞密度降低,并出现纤维组织增生，联合用药组兼具这 两种表现且坏死面积更大。免疫荧光及免疫组化结果显示，联合用药增加了 CD3 及活性casepase-3的表达，显示联合用药增加了肿瘤浸润淋巴细胞与细胞凋亡。6.二甲双胍组与PD-1联合用药，联合用药CD3表达及活性casepase-3表达 增加，显示联合用药增加了肿瘤浸润淋巴细胞与细胞凋亡。结论1.相比于单独用 药，雷帕霉素与PD-1单抗联用通过降低PD-L1表达水平，增加肿瘤浸润淋巴细胞 数量，促进凋亡，显著抑制TNBC小鼠肿瘤生长。2.二甲双胍与PD-1单抗联用通过降低PD-L1表达水平，增加肿瘤浸润淋巴细 胞,显著增强了二甲双胍对TNBC小鼠肿瘤的抑制作用。3.雷帕霉素通过抑制mTOR 活性，降低PD-L1的表达水平。二甲双胍降低PD-L1表达水平，与雷帕霉素一致，提示可能通过调控 AMPK/mTOR通路，抑制mTOR降低PD-L1表达水平。
