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1、实验2 急性DIC实验时间：5月23日【实验目的】1、学习复制急性DIC动物模型的方法。 2、了解实验室诊断DIC的常用方法及其意义。3、结合实验和血液学指标测定结果，联系理论知识加深理解DIC的病因及发生机制。【实验对象】家兔1只，雌（未孕）雄均可。体重 1.52.0 kg。【药品和试剂】1%普鲁卡因、3.8%枸椽酸钠液、2%兔脑粉浸出液（临用时配制）、饱和氯化钠液、生理盐水、1%鱼精蛋白液。【实验器材】兔台、哺乳动物手术器械一套（包括手术刀、普通剪刀、眼科剪刀、止血钳）、电热恒温水浴箱、台式离心机、721分光光度计、秒表、刻度离心管（10ml）、试管（1375mm、15100mm）、刻度吸
2、管（2ml、5ml）、试管架、微量定量移液器（10l、50l、500l）、橡皮吸球、乳胶滴管、玻片、棉球、纱布、颈动脉插管（硅胶管）2根、动脉夹，注射器。【实验方法】1、将家兔仰位固定兔台、颈部剪毛、皮下1%普鲁卡因局部浸润麻醉，作正中纵切口（约34cm左右），常规暴露一侧颈总动脉，结扎其远心端，近心端用动脉夹夹闭；在结扎线下方剪口插入硅胶管并固定，松夹放血7ml至盛有3.8%枸椽酸钠液2ml的10ml刻度离心管中，立即混匀离心（3000rpm，5分钟），分离血浆，备作纤维蛋白原定量与3P试验。再松动动脉夹放血23滴于洁净玻片上，作凝血时间测定。2、复制DIC模型：用10ml注射器吸取2%兔脑
3、粉浸液，按3ml/kg的量缓慢（以每分钟2ml的速度为宜）注入家兔耳缘静脉内，同时观察其反应，如出现呼吸急促、躁动不安，即停止注射，速行第二次采血（方法同1），如未出现反应可注射毕后采血。重复上述各项指标测定。4、整理并分析实验结果。【附 录】1、凝血时间测定（玻片法）：放血23滴于洁净玻片上，同时按动秒表，用清洁废针头挑拨血滴，见有明显血丝出现，迅即停表，记录时间。2、纤维蛋白原含量测定（饱和盐水法）：取15100mm试管一支，置0.5ml样本血浆，加入饱和氯化钠溶液4.5ml，立即混匀，于37水浴中孵育3分钟取出，再混匀后以721分光光度计，520nm滤光板比浊，读取光密度值；以生理盐水替
4、代饱和氯化钠液作同样操作后为空白对照管调零，测出光密度，按下式计算； 3、3P试验：取1375mm试管一支，置0.5ml血浆，加入1%鱼精蛋白液0.05ml，轻轻摇匀，于37水浴中15分钟后取出，于黑色背景下观察，如见絮状沉淀或胶冻状即为阳性，清澈则为阴性。【实验结果】组别CT(min)3P testOD520nmFbg(mg/dl)OD520nmFbg(mg/dl)正常注射后正常注射后N测D测1/2132618-0.1863720.0951903022122-+0.2054100.0931864055050/140-+0.2484960.112/0.116224/2325120220-+0.
5、1202400.1022046024/-0.2314620.04284【讨论】1、家兔实验性DIC的致病原因：兔脑脊液属于组织因子，大量的兔脑脊液静脉注射后，激活家兔的外源性凝血系统，启动凝血过程，依次激活凝血因子FIX,FVIII,FX等和凝血酶，从而使血小板聚集，使纤维蛋白原变成纤维蛋白，促进凝血。此外，凝血酶反馈性激活FIX,FX,FXI,FXII等，扩大凝血反应。此为高凝期，微循环易形成广泛的微血栓。大量凝血酶的激活和微血栓的形成，大量消耗了血液中的凝血因子和血小板，可能继发性激活纤溶系统，造成凝血系统和纤溶系统不平衡，血液处于消耗性低凝期，有明显出血症状。DIC时产生的大量凝血酶和F
6、XIIa等激活纤溶系统，产生大量纤溶酶，导致纤溶亢进，形成大量纤维蛋白降解产物，抗凝作用明显，为继发性纤溶亢进，此时出血十分显著。（厉彬杰）2、CT测定的原理：新鲜血液离体后，因子被异物表面（玻璃）激活，启动了内源性凝血。由于血液中含有内源性凝血所需的全部凝血因子、血小板及钙离子，血液则发生凝固。血液凝固所需时间即为凝血时间（clotting rime，CT）。3、由实验结果分析，3.1发生DIC后，凝血时间变长。机制：凝血物质被消耗而减少：在DIC发生、发展过程中，大量血小板和凝血因子被消耗，使得血液中纤维蛋白原、凝血酶原、F、F、F及血小板明显减少，使凝血过程发生障碍。纤溶系统激活：血液中
7、F激活的同时，激肽系统也被激活，产生缓激肽酶，使纤溶酶原变成纤溶酶，激活纤溶系统。纤溶酶除了可使纤维蛋白降解外，还可水解凝血因子，如：F、F、凝血酶、F等，使凝血功能发生障碍，使得凝血时间变长。纤维蛋白（原）降解产物形成：在凝血过程中，凝血酶使纤溶蛋白原转变为纤维蛋白单体，最终形成交联的纤维蛋白多聚体。纤溶系统激活后，纤溶酶分解纤维蛋白原，裂解出纤维肽A和纤维肽B，余下片段为X片段，继续被分解为D片段和Y片段，Y片段可继续分解为D和E片段。如果纤维蛋白原先经凝血酶作用为纤维蛋白，纤溶酶再分解纤维蛋白，则可使其分解为X、Y、D、E及各种二聚体、多聚体等片段。纤溶酶水解纤维蛋白（原）片段，统称为纤
8、维蛋白（原）降解产物（FDP）。这些片段有明显的抗凝作用，如：X、Y、D片段可妨碍纤维蛋白单体聚集，Y、E片段有抗凝血酶作用。此外，多数碎片可与血小板膜结合，降低血小板的黏附、聚集、释放等功能。3.2发生DIC后，有些组3P实验呈强阳性，有些阳性不强或阴性。机制：3P试验即血浆鱼精蛋白副凝试验，其原理是：鱼精蛋白可与FDP结合，将其加入患者血浆后，血浆中原与FDP结合的纤维蛋白单体与FDP分离后彼此聚合，形成不溶的纤维蛋白多聚体。在DIC继发性纤溶亢进期，由于纤溶系统激活，产生大量纤溶酶。纤溶酶大量降解纤维蛋白多聚体，产生大量FDP。FDP与sFM在血浆中可形成可溶性复合物，不会降解。加入鱼精
9、蛋白后，可溶性复合物解离，游离出的FM便会相互聚合形成不溶性的肉眼可见的颗粒状、絮状或胶冻状沉淀，因此可观察到阳性反应。出现阴性结果的原因：由于DIC激活外源性凝血通路， 导致大量纤维蛋白原形成纤维蛋白单体及多聚体，因此3P实验应该可见沉淀，呈阳性。到实际上未能观察到阳性反应，可能为采血时家兔已处于DIC中晚期，sFM也在纤溶酶的作用下降解成FDP，而3p实验要求较大分子量的FDP或sFM，因此未能形成沉淀。3.3发生DIC后，纤维蛋白原含量减少。机制：在凝血过程中，凝血酶使纤溶蛋白原转变为纤维蛋白单体，最终形成交联的纤维蛋白多聚体。纤溶系统激活后，纤溶酶分解纤维蛋白原，裂解出纤维肽A和纤维肽
10、B，余下片段为X片段，继续被分解为D片段和Y片段，Y片段可继续分解为D和E片段。如果纤维蛋白原先经凝血酶作用为纤维蛋白，纤溶酶再分解纤维蛋白，则可使其分解为X、Y、D、E及各种二聚体、多聚体等片段。纤溶酶水解纤维蛋白（原）片段，统称为纤维蛋白（原）降解产物（FDP）。这些片段有明显的抗凝作用，如：X、Y、D片段可妨碍纤维蛋白单体聚集，Y、E片段有抗凝血酶作用。此外，多数碎片可与血小板膜结合，降低血小板的黏附、聚集、释放等功能。DIC晚期，纤溶系统激活后，纤溶酶分解纤维蛋白原，产生纤维蛋白降解产物，因此，纤维蛋白原含量减少。4、弥散性血管内凝血（DIC）的分期及治疗：高凝期：又称弥漫性微血栓形成
11、期。病初，机体的凝血活性增高，以微血栓形成为主要特点，加之血小板的粘附性增高，各脏器微循环可有严重程度不同的微血栓形成。因此，该期治疗应在于抑制广泛性微血栓形成，防止血小板及各种凝血因子进一步消耗，即治疗以抗凝为主。消耗性低凝期：该期主要特点为大量凝血因子的持续消耗和血小板的减少，且继发性纤溶功能增强。因此会出现严重程度不等的出血症状，也可能有休克或某脏器功能障碍的临床表现。该期微血栓形成仍在进行，抗凝治疗仍然非常重要，但因凝血因子的进行性消耗，故应补充血小板和凝血因子。继发性纤溶亢进期：该期微血栓形成已基本停止，主要特点为继发性纤溶亢进。大多有严重程度不同的临床出血症状，严重病人有休克及多器
12、官功能障碍综合症（MODS）的临床症状。若临床确认纤溶亢进是出血首要原因，则可适量应用抗纤溶药物，同时，由于凝血因子和血小板消耗，也应积极补充。5、DIC的治疗:DIC早期（弥漫性微血栓形成期）以微血栓形成为主，此期治疗目的在于抑制广泛性微血栓形成，防止血小板及各种凝血因子进一步消耗，因此治疗以抗凝为主。DIC中期（消耗性低凝期）此期微血栓形成仍在进行，抗凝治疗仍然必不可少，但因凝血因子进行性消耗，临床中引发出血情况，故在充分抗凝基础上，应进行补充血小板和凝血因子的替代治疗。DIC晚期（继发性纤溶亢进期）此期微血栓形成已基本停止，继发性纤溶亢进为主要矛盾。若临床确认纤溶亢进是出血首要原因，则可
13、适量应用抗纤溶药物，同时，由于凝血因子和血小板消耗，也应积极补充。6、实验中出现失误，动脉夹松掉大量出血，导致兔子提前死亡。实验中出现这种情况时，应立即找到出血原因，如本实验中应重新夹好动脉夹，使实验得以继续进行7、广泛的微血栓形成使回心血量明显减少，加上广泛出血造成的血容量减少等因素，使心输出量减少, 加重微循环障碍而引起休克。DIC形成过程中产生多种血管活性物质(激肽、补体C3a和C5a),造成微血管平滑肌舒张，通透性增高，回心血量减少。 预防和去除引起DIC的病因是防治DIC的根本措施。采用扩充血容量、解除血管痉挛等措施及早疏通阻塞的微循环。在高凝期可应用抗凝药物如肝素、低分子右旋糖酐、
14、 阿斯匹林等阻止凝血过程的发动与进行，预防新血栓的形成。出血倾向十分严重的病人，可输血或补充血小板等凝血物质以及使用纤溶抑制剂。8、注意事项8.1采血时不得将动脉夹移开，以免放血后不能及时8.2夹闭动脉造成放血过量和失血。8.3采集抗凝血需掌握好血液:抗凝剂之比例(1:9)并充分混匀(颠倒混匀)。8.4注射兔脑浸液前，要做好第二次采血的一切准备工作，如换好新的动脉插管(因原来插管内可能已有血栓阻塞)，或向导管内注入生理盐水。8.5注射兔脑浸液是实验成败的关键步骤，要缓慢推注(2m1/min)，同时密切注意家兔反应，如有明显的呼吸急促和躁动不安，应立即放血。【结论】在DIC继发性纤溶亢进期，血液的凝血时间变长，纤维蛋白原含量减少，3P试验阳性。在DIC继发性纤溶亢进期晚期，由于sFM被分解，3P试验阴性。
