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1、硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素之纯化和生物学活性鉴定马卫列,刘芳,何承伟,何振辉【关键词】蛋白Purificationofmouseendostatininthioredoxinfusionexpressionsystemandidentificationofitsbiologicalactivity【Abstract】AIM：Topurifymouseendostatinbyusingthioredoxinfusionexpressionsystemandtoidentifyitsbiologicalactivity.METHODS:ThepThioHisendorecombina
2、ntplasmidwastransformedintoBL21.AfterinductionwithIPTG,thioredoxinendofusionproteinwasexpressedinBL21andtheproductwasidentifiedasinclusionbodybySDSPAGE.TheexpressionproductwaspurifiedbyaffinitychromatographythroughNicolumn.Thepurifiedproteinwasdetectedbychickenchorioallantoicmembrane(CAM)angiogenesi
3、sinhibitoryassayandendothelialcellproliferationinhibitoryassay.RESULTS:HighpuritythioredoxinendostatinfusionproteinwasobtainedbySDSPAGaEnalysis.Thepurityoftheproteinwasover95%.TheproteinpossessedtheinhibitoryactivityofendothelialcellproliferationandinhibitedtheangiogenesisofCAMinhibitoryrate:,and.CO
4、NCLUSION:Themouseendostatinrecombinantfusionproteinexpressedinbyusingthioredoxinfusionexpressionsystemiseasytobepurifiedandpossesseshighactivity.【Keywords】endostatin；thioredoxinfusionexpressionsystem；fusionprotein【摘要】目的：将硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素(endostatin)进行纯化并对其生物学活性进行测定.方式：将含有pThioHisendo重组质粒转化大肠杆菌BL
5、21,经IPTG(异丙基BD硫代半乳糖甘)诱导表达重组融合蛋白，SDSPAG分析表达产物为包涵体，将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析取得纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素，经SDSPAGE析鉴定.将纯化的蛋白质通过鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和内皮细胞抑制实验对纯化的蛋白质进行生物学活性测定.结果：经SDSPAGE泳分析取得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白，纯度可达95%，得率为g/L.纯化的重组蛋白在体外能抑制鸡胚囊膜血管生成及具有抑制血管内皮细胞增殖的活性，加入重组蛋白内皮抑素5wg组与10wg组血管生成抑制率别离为%和，P<，和对照组通过方差分析,不同都有显著性意义；内皮细胞抑制实验可见不同
6、剂量重组蛋白内皮抑素对内皮细胞的生长具有抑制作用抑制率别离为，通过方差分析和相关性分析，具有剂量依托效应(r=,P<；.结论：用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.【关键词】内皮抑素；硫氧还蛋白融合表达系统；融合蛋白0引言内皮抑素(endostatin)是OReilly等1于1997年发觉的一种血管生成抑制剂，相对分子质量Mr为20000.Yamanaka2实验发觉，将含有内皮抑素基因的病毒注入小鼠脑瘤瘤体内可明显抑制肿瘤生长，减少瘤组织血管生成；刘江秋等3发觉，重组血管内皮抑素能抑制小鼠黑色素瘤生长、转移及新生毛细血管的形成.过去的抗癌药有
7、较大的副作用，而内皮抑素通过与血管内皮细胞表面的整和素(integrin)结合抑制新生血管的形成4，操纵肿瘤细胞的生长和转移，对正常细胞没有任何不良阻碍.为了探讨内皮抑素用于肿瘤生物医治的可行性，咱们利用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中实现了对内皮抑素的高效表达，通过镍柱亲和层析对内皮抑素融合蛋白进行纯化，取得可溶性的内皮抑素融合蛋白，对纯化后的融合蛋白进行生物学活性鉴定，为以后大量生产及临床应用奠定基础.1材料和方式材料硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA质粒由中国农业大学生物学院微生物系杨苏生教授惠赠；pThioHisAendo重组质粒由本室制备，NickelChelateAffin
8、ityMatrix（NiCAM）树脂购自Sigma公司，大肠杆菌BL21菌株为本室保留；甲叉双丙烯酰胺、溶菌酶、氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原型谷胱甘肽（GSH）、蛋白质标准Marker、脱氧胆酸钠、IPTG购自华丽生物工程公司.方式实验分组融合蛋白表达实验分为2组：加入IPTG至终浓度1mmol/L的诱导组，诱导5h;另一组为未加IPTG组.鸡胚囊膜（CAM血管生成抑制实验分为3组：对照组（n=5）,5wg内皮抑素加样组（n=5）,10wg内皮抑素加样组（n=5）.内皮细胞抑制实验分为5组（每组n=5）:对照组，25,50和100wg内皮抑素加样组.含目的基因的重组质粒pThioHisAen
9、do融合蛋白的表达重组质粒转化感受态细菌：用mmol/LCaCl2处置BL21细菌，制备感受态细菌；力口10mg/LpThioHisendo重组质粒2L入100L感受态细菌中，冰浴30min；42水浴热休克2min，37水浴5min，冰浴2min；加1mL不含氨节的LB培育基，37c水浴1h.取200区L菌液涂布于含100mg/L氨节的LB平板上，37c培育20h.融合蛋白表达的诱导：挑取单菌落接种于2mL含氨节的LB液体培育基中，37c振荡培育留宿，共挑8个菌落，第二天取20wL菌液加入2mLLB培育基，37c培育至A590nm为左右.表达产物的鉴定取上述IPTG诱导5h后的菌液10wL,1
10、000r/min离心5min,将沉淀弹匀，加入1LPMSF（苯甲基磺酰氟）、5wL溶菌酶和1g/L脱氧胆酸5wL,不断摇动混匀，使细菌裂解，力口1X106U/LDNasel5L,混匀，37c1h,离心（4C,12000g，15min），沉淀为不溶解蛋白，上清即为可溶性蛋白，别离取上清液和沉淀，加入上样缓冲液，滚水浴5min,用100g/LSDSPAGE进行电泳，g/L考马斯亮蓝R250染色，挑选阳性菌落.电泳终止后确信融合蛋白为包涵体，5号和6号克隆表达最高.融合蛋白的提取工程菌的发酵：取IPTG诱导5h后的6号克隆菌液mL至2L含氨节的LB培育基中，37c培育5h左右至A590nm为，加入I
11、PTG至终浓度1mmol/L,诱导5h,2500g,4C,离心8min,搜集诱导表达的菌体.包涵体的取得：细菌沉淀悬浮于200mLbufferA（mol/LTrisClpH，5mmol/LEDTA），加入溶菌酶（50mg/L），30c放置15min,加入1g/L脱氧胆酸钠（SOC,超声破碎10s,5次；8000g,4c离心10min,弃上清，得包涵体.包涵体的洗涤：沉淀重悬于含1g/LSOC的bufferA中，8000g，4，离心10min，弃上清；沉淀再次重悬于含1g/LSOC勺bufferA中洗涤，8000g,4C,离心10min.包涵体的溶解：沉淀用30mLbufferB（mol/LTr
12、isClpH,10g/L十二烷基肌酸钠，1mmol/LDTT）溶解,8000g,4C,离心10min,取上清液.包涵体的透析和复性：上清转入截留相对分子质量Mr为8000的透析袋中，于1500mLbufferC（mol/LTrisClpH，mmol/LDTT）4透析4h，再重复透析1遍；样品再次放入1500mLbufferD（mol/LTrisClpH）中透析4h，2遍；样品再次放入1000mLbufferE（mol/LTrisClpH，mmol/LGSSG，1mmol/LGSH）透析4h，2遍.最后样品放于mol/LTrisClpH透析5h，2遍.银柱亲和层析进一步纯化内皮抑素融合蛋白：将4
13、0mL（每毫升树脂能够纯化蛋白质20mNiCAM亲和树脂（200mL/L乙醇保留）装到层析柱里，用100mL去离子水清洗树脂，再用150mL平稳液（50mmol/L磷酸钠pH，mol/LNaCl，10mmol/L咪唑）冲洗，去除乙醇残留.将待纯化的蛋白质溶液加到层析柱内树脂上，调剂液体流出速度为25滴/min,并加平稳液冲洗.待纯化的蛋白质溶液过柱完成后，继续用平稳液冲洗NiCAMg和树脂层析柱，当过柱后的平稳液A280nm维持稳固，接近平稳液本身的pH值时用洗脱液（50mmol/L磷酸钠,pH,mol/LNaCl,250mmol/L咪噪）洗脱含目的蛋白的NiCAM亲和树脂，搜集含有目的蛋白的
14、洗脱液.考马斯亮蓝法测蛋白浓度，计算蛋白质取得率，再次SDSPAGE胶电泳，鉴定蛋白质纯度.蛋白溶液保留于-20中，供活性测定利用.内皮抑素融合蛋白生物学活性的测定CAMfc管生成抑制实验：孵育7d的受精鸡胚蛋壳开1cm2左右的小窗口，将纯化的重组融合蛋白内皮抑素加样于放置在CAMt的灭菌滤纸上，在恒温恒湿培育箱培育48h，掏出鸡胚，局部用固定液固定，固定后剪下覆盖滤纸的CAM弃去滤纸，把CAM1于干净的载玻片上，制成永久性标本.在光学显微镜或解剖镜下随机选取5个视野，计算滤纸覆盖范围内可见的血管分支点的数量.血管生成抑制率按下面的公式计算：血管生成抑制率（）=（1给药组血管分支点数/对照组血
15、管分支点数）.内皮细胞抑制实验：体外培育人脐带静脉内皮细胞ECV304传至5代后，调整细胞密度为1X108/L,接种于96孔板,每孔90wL,常规培育46h后弃上清，加入不同浓度培育液稀释的纯化蛋白10wL/孔，对照组加入10wL培育基，60h后加入5g/LMTT20wL/孔，继续孵育4h,吸去上清加入DMSO150lL/孔，震荡10min,在酶联免疫检测仪490nm处读数.统计学处置：本实验数据均采纳x士s表示，SPSS评估版统计软件进行单因素方差分析和相关性分析，P<表示不同有统计学意义.2 结果融合蛋白表达的鉴定SDSPAGE析说明，含pThioHisAendo的工程菌经IPTG诱导后，表达产物在相对分子质量Mr约32X103处显现了1条明显的新蛋白带，其大小与理论推算的融合蛋白相对分子质量相符合（内皮抑素Mr为20X103,thioredoxinMr为X103）,未经IPTG诱导的菌体实验组在相应位置没有明显表达（图1）.上清和沉淀进行SDSPAGE5胶电泳中测发觉，thioredoxin/内皮抑素融合蛋白要紧以包涵体形式存在于沉淀中，菌体裂解物上清在相应位置没有明确条带显现（图2）.图1100g/LSDSPAGEg定pThioHisAendo重组质粒在大肠杆菌BL21中的表达图2100g/LSDSPAGE电泳鉴定银柱亲和层析纯化的硫氧还融合蛋白
