链霉素的制备(2)

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1、链 霉 素 的 生 产组别：第二组编制时间：2012.10.24总页数：13组员：陈镪 文庆 丁梦瑶 向莉 卢媛一、抗生素抗生素(antibiotics)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程 中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的 化学物质。现临床常用的抗生素有微生物培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的 化合物。抗生素以前被称为抗菌素，事实上它不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体等其它致 病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，近年来通常将抗菌素改称为抗生素。抗生素可以是某 些微生物生长繁殖过程中产生的一种物质，用于治病的

2、抗生素除由此直接提取外；还有完全 用人工合成或部分人工合成的。通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种细菌感染或抑制致病微 生物感染的药物。二、抗生素分类B -内酰胺类：青霉素类和头抱菌素类的分子结构中含有B -内酰胺环。氨基糖苷类：包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖 霉素、小诺霉素、阿斯霉素等。1. 四环素类：包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。2. 氯霉素类：包括氯霉素、甲砜霉素等。3. 大环内脂类：临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交 沙霉素等、阿奇霉素。4. 糖肽类抗生素：万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁，后者在抗菌活性、药代

3、特性及安全 性方面均优于前两者 。5. 喹诺酮类：包括诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、加替沙星等。6.硝基咪唑类：包括甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等。7作用于G-菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。8. 作用于G+细菌的其它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、杆菌肽等.9. 抗真菌抗生素：分为棘白菌素类、多烯类、嘧啶类、作用于真菌细胞膜上麦角甾醇的抗真 菌药物、烯丙胺类、氮唑类。10. 抗肿瘤抗生素：如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。11. 抗结核菌类：利福平、异烟肼、吡嗪酰胺等。12. 具有免疫抑制作用的抗生素如环孢霉素。三、链霉素概述链霉素（strept

4、omycin） 疋 -种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12，分子量： 581.59 。毒性LD50（mg/kg）：对许多革兰氏染色阴性或阳性细菌有效，鼷鼠急性经口 9000。对人低 毒。溶解情况：易溶于水，微溶于乙醇，不溶于甲醇、氯仿和丙酮。制备或来源：由灰色链霉菌的发酵液提取得的一种抗生素用途：抗菌范围比较广。对革兰阴性细菌、结核杆菌和某些革兰阳性细菌都有抑制作用。主要用 于结核杆菌感染，也可用于布氏杆菌病、鼠疫等。用于肌肉注射的，除硫酸盐外，还有盐酸 盐、磷酸盐等。 本品能被植物植株吸收，对革兰氏阴性菌和阳性菌杀伤力强，预防效果明 显，低温时持效期一般为7天左右，晴天34天。

5、本品适用于防治蔬菜软腐病，柑桔溃疡 病，烟草野火病，黄瓜霜霉病、角斑病，辣椒炭疽病，番茄疮痂病，桃叶细菌性穿孔病，水 稻拜叶枯病及其他植物细菌性病害。使用方法：1、可喷雾（每袋加水50100kg）、灌根或 浸种；2、用于预防，每袋加水50kg （相当于200r），根据病害程度每亩用23袋；施药时 间最好在上午10点前、下午3点后，喷药8小时内遇雨应补喷。使用间隔期为710天。 本品对柑桔溃疡病、疮痂病、花叶病均有防治效果，可与抗生素农药、有机磷农药混用。 备注：常用其硫酸盐，有引湿性。在空气或日光中稳定。醛基还原成醇，即得双氢链霉素， 其抗菌活性与链霉素相似。包装及贮运：贮存于阴凉干燥处，严防

6、潮湿，现用现配、农药不宜久放，避免与碱性农药、 污水混用。四、链霉素的作用机理链霉素主要与原核细胞（如 细菌）核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质（酶）的合成, 使细菌不能正常生长或者代谢而死亡。链霉素的结构：链霉素是由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺组成的三糖苷，属于氨基糖苷类抗 生素。链霉胍是在1，3-位置上带有2个孤基的1，3-去氧青蟹肌醇，去掉2个脒基后称为链 霉胺。链霉糖是带有支链的5，-脱氧五碳糖，在第3碳上有一个醛基。N-甲基-L-葡萄糖胺是 在第2碳上的-NH2被甲基化(-CH3NH)的L-葡萄糖胺。这三糖连接的糖苷键都是a型的糖苷 键。五、工艺合成方法1、传统工艺一般

7、采用蒸汽加热(7075C)方法使蛋白质凝固变性。添加磷酸或一些络合剂如三聚 磷酸等使高价离子草酸、磷酸生成不溶性沉淀物，然后通过板框过滤或离心分离将这些沉淀 物除去。这一预处理将导致10%以上的链霉素所添加的草酸、磷酸或络合剂，既增加了链 霉素提炼成本，又会降低产品纯度、污染环境。同时所得的发酵滤液中仍存在许多蛋白、多 肽和其它各种杂质，将会减少树脂的吸附容量或污染树脂，造成树脂的沉降和堵塞，进而缩 短树脂的寿命，增加抗生素提炼的成本。链霉素早期的提取方法还有活性炭吸附法、 带溶法、沉淀法、离子交换法。2、国外工艺目前国内外多采用离子交换法提取链霉素，其工艺流程如图:发酵液酸化*过滤或离心 离

8、子交换+活性染脱色酸性、中性脱色十義膜浓缩操 作流 程 图：发酵液I倍最水稀释垃酢雀草T餓化液喪概化pHZ 乱玄加烘中相】过St或离心1_ 販框过赠或囲怵排出式离心分陶f ”I冷却至下 1N也率树脂吸附NaOH 中相 pHG. 7-7- 2他0 万哉at(二次洗麗)*中和濾液悒和树脂精制液先用无耐挤氐删吹HiSOt锹虢确篩决脫3-4歐炭脱色74D1轉脂噪附.f 旳万 Or/ail)【精甜I中1 X M H举植帘 30OH型中和精脱液H申调问步J酸性脱色液 甜歸祜性炭00266MP1(24万 LJ/nd匸中性脱芭JCa(OHr调pH5. 5氐。成rm诫缩進5 无繭对谑粧城I沁135 航倉链霉素越

9、星出凤六、操作步骤本品生产主要采用离子交换法。发酵生产过程分为两大步骤： 菌种发酵，将冷干管或沙土管保存的链霉菌抱子接种到斜面培养基上，于27C下培养7 天。待斜面长满抱子后，制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27C下培养4548小时待 菌丝生长旺盛后，取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种于种子罐内已灭菌的培养基中， 通入无菌空气搅拌，在罐温27C下培养6263小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中， 通入无菌空气，搅拌培养，在罐温为27C下，发酵约78天。 提取精制，发酵液经酸化、过滤，除去菌丝及固体物，然后中和，通过弱酸型阳离子交 换树脂进行离子交换，再用稀硫酸洗脱收集高浓度洗脫液一期

10、霉素硫酸盐溶液。洗脫液再 经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和后，再经活性炭脱色得到 精制液。精制液经薄膜浓缩成浓缩液，再经喷雾干燥得到无菌粉状产品，或者将浓缩液直接 做成水针剂。发酵工艺流程图：七、链霉素生产知识介绍1. 链霉素的生物合成途径1. 由D-葡萄糖和NH3合成链霉素的大致途径如图1所示NTI.差向异杓化二一丸盼匕二克眛基化Vbk甲基丄-葡萄精庶衍生物D-葡苗楠换书-4習氨疏k1 * I哥氨酸 *將氨酸*y / 徒霉恥确醸酣-*瓜氯酸心热霉素甘露鮭讎塞食图1镀毎素的主物合成途径或磷酸化術生埶从图l可看出，每生成1个链霉素分子都需消耗3个葡萄糖分子、7个HN分子

11、、32个CO分子和l个甲硫氨酸分子。其中，有3个“也分子是通过转氨基反应，分别把 氨基供体一谷氨酰氨、丙氨酸和谷氨酸的氨基结3合到链霉胍上和L-葡萄糖胺的氨 基上，另外4个NH分子是通过鸟氨酸环供给的，其中2个分子又由氨甲酰磷酸酯, 3另外2分子由天冬氨酸引入，最后转变为精氨酸的脒基，再转移到链霉胺衍生物 上。2个CO也是通过鸟氨酸循环固定的。2在灰色链霉素的发酵过程中，与链霉素同时产生的还有甘露糖链霉素（链霉 素B），其化学结构为N-甲基-L-葡萄糖胺的C与D-甘露糖的C以D-糖苷键相连接的 糖苷，经过甘露糖苷酶作用，可水解为链霉素和甘露糖。2. 链霉素生物合成的调节机制在链霉素生物合成中的

12、调节机制主要有发酵阶段的转变、分解产物的调节以 及无机磷的反馈抑制等方面。2.1 发酵阶段的转变催化链霉胍的2个转脒基反应的酶，在合成阶段开始时的突然出现是由于新 的蛋白质的合成，而不是蛋白质的激活。2.2 分解代谢产物的调节在发酵过程中，除形成链霉素外，还形成一种支路产物一甘露糖链霉素（又 叫链霉素B）。对大多数微生物来说，甘露糖链霉素的生物活性只有链霉素的 20%-25%。直到发酵后期才产生水解甘露糖链霉素的a-D-甘露糖苷酶，能迅速 把甘露糖链霉素水解成链霉素和甘露糖，反应如下：甘露糖苷酶链霉素-甘露糖链霉素+甘露糖2.3 无机磷的反馈抑制正常生长所需的无机磷浓度抑制链霉素的形成。磷酸盐

13、与链霉素的生物合成 过程有密切关系，在链霉素生物合成中有几步磷酸酯酶所催化的去磷酸化反应。 过量的磷酸盐会产生反馈抑制，阻抑这几步的一个或多个磷酸酯酶的活性或形 成，因而抑制链霉素的合成，因此磷酸酯酶的活力与链霉素的形成有密切关系。 此外磷酸盐还能调节链霉胍合成的关键酶一一脒基转移酶的形成，高浓度磷酸盐 严重阻遏该酶的形成。2 代谢控制发酵育种的基本思想4代谢控制发酵（Me tabolic con trol fermen tat ion）就是利用遗传学的方法或 其它生物化学的方法，人为地在脱氧核糖核酸(NDA)的分子水平上，改变和控制 微生物的代谢，使有用产物大量生成、积累的发酵。微生物细胞具

14、有高度适应环 境和繁殖的能力，这种调节控制作用主要靠两个因素，即参与调节的有关酶的活 性和酶量，也就是反馈抑制和反馈阻遏。代谢调控发酵能否获得成功， 目的产 物的产量高低与否，关键在r微生物细胞自我调节控制机制是否能够被解除，能 否打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。根据代谢控制机制的研究表明，酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制。 一方面，从DNA的分子水平上阐明了酶生物合成的控制机制，酶的合成受基因的 控制，有基因决定形成酶的分子化学结构；另一方面，从酶学的角度探讨，仅仅 有某种基因，并不能保证大量产生某种酶。酶的合成还受代谢物(酶反应的底物、 产物及其类似物)的控制和调节。

15、最有效的方法就是造就从遗传角度解除了微生物正常代谢控制机制的突变 株。突破微生物的自我调节控制机制，而使代谢产物大量积累的有效措施如下：(1) 应用营养缺陷型菌株。在这些缺陷型菌株中，由于合成途径中某一步骤 发生缺陷，终产物不能积累，这样就解除了终产物的反馈调节，使之间产物积累 或另一分支途径的末端产物得以积累。(2) 选育抗反馈调节的突变株。由于这样的突变株不再手正常反馈调节作用 的影响，使终产物得以积累。(3) 选育细胞膜通透性突变株，以便使终产物在细胞内不能积累到引起反馈 调节的浓度。(4) 利用营养缺陷型回复突变株或条件突变株的方法，解除终产物对关键酶 的调节。(5) 应用遗传工程技术，创造理想的超微生物(即构建目的工程菌株)。此外，发酵的环境条件，如pH值、NH的供应、溶氧水平、营养浓度控制表 面活性剂的使用等也都非常重要。3 链霉素生产菌的育种思路根据链霉素生物合成途径及代谢调节机制，选育链霉素生产菌应从如下几个 方面着于：3.1 出发菌株的选择出发菌株多采用灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、比基尼链霉菌和灰色 链霉