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1、Western Blotting本次试验的目的是使同学们掌握WesternBlotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉 Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。Western Blotting的 blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975 年， Southern建立了将 DNA 转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA RNA 杂交检测特定的 DNA 片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA 和蛋白质进行印迹分析，对RNA 的印迹分析称为Northern印迹法，
2、对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern 印迹法。Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。它通常分为两种方法：Western Blotting方法一 : 直接法方法二 : 间接法优点：1.快速（一种抗体）1.免特异性不受标记影2.没有二抗交叉反应引起响的非特异性条带2.信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择4. 可选择不同的 Marker缺点：1.免疫反应性降低1. 交叉反应引起的非特2.无信号二级放大异性条带3. 抗体标记费时昂贵 , 使 2. 额外的二抗孵育
3、以及用不方便条件优化同时 Western又具有多种识别蛋白质的显色方法， 主要有以下几种： i. 放射自显影ii. 底物化学发光 ECLiii.底物荧光 ECFiv. 底物 DAB 呈色 现常用的有底物化学发光ECL 和底物 DAB 呈色。一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质为抗原， 与之对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放
4、射自显影以检查电泳分离的提议目的蛋白成分。 蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性高、 敏感等诸多优点， 能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr) 、N,N- 甲叉双丙烯酰胺 (Bis) 和催化剂 (AP) 、加速剂 (TEMED 聚合成的三维网孔结构(凝胶）。据有无浓缩效应可将电泳分为两类：i. 连续系统：缓冲液 pH 值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效应区分。ii. 不连续系统：缓冲离子成分、 pH 值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应、 分子筛效应、浓缩效应区分。SDS-PAGE 的原理是：依靠SDS 带有大量
5、负电荷来掩盖蛋白质表面的净电荷：同时由于在电泳溶液中加入了SDS 和巯基乙醇，因此它还可以改变蛋白质构象：在实验中要注意： 印迹法需要较好的蛋白质凝胶电泳技术，是蛋白质样品达到良好的分离效果，而且要注意胶的质量，是蛋白质容易转移带固相支持物上，另外蛋白质在电泳过程中分离得到的条带被保留在膜上，在随后的宝物阶段不丢失和扩散。免疫印迹分析之需要很小体积的时间，较短的时间过长，操作容易，适用于理论和应用上的研究。本实验采用人血清为材料，人类Ig 根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类： IgG 、IgA 、IgM 、IgD 、IgE 。其中 IgG 占血清免疫球蛋白总量的 75% 8
6、0% 。人的 IgG 由两条重链和两条轻链组成，它们之间以二硫键相连。在加SDS 的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。对此样品进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上， 用兔抗人 IgG 为第一抗体，用辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体，在过氧化物酶第五存在的情况下，检测人的IgG 。二、试剂，器材和实验材料【试剂】1. 30 丙烯酰胺贮备液： 29.2g 丙烯酰胺， 0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至 100ml 。2.浓缩胶缓冲液： 0.5mol/L
7、 Tris-HCl，pH6.8 。3.分离胶缓冲液： 3mol/L Tris-HCl，pH8.9 。4. 10 过硫酸铵 (w/v) ：临用前用蒸馏水配制。5. 10 SDS(w/v) 。6. 10 TEMED 。7.电极缓冲液：甘氨酸11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g,加水至 800ml ，pH8.3 。8. 样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH6.8 ，20 甘油，4 SDS，10 巯基乙醇， 0.005 溴酚兰。9. 考马斯亮蓝 R250 染色液：考马斯亮蓝 R250 0.25g ， 30% 乙醇， 10% 冰乙酸。10. 脱色液：乙醇 6ml
8、 ，冰乙酸 2ml ，加水至 20ml 。11. TBS（Tris-HCl,NaCl ）缓冲液： 20mmol/L Tris-HCl,12. 500mmol/L NaCl ， pH7.5 ，每组配 150ml 。13. TTBS：取 100mlTBS ，加 250 l 20 Tween-20 。14. 封闭液及抗体稀释液： 3脱脂奶粉 -TBS ，每组配 10ml 。15. 底物溶液： 2.5mg 二氨基联苯胺（ DAB ） + 10mlTBS +10l H2O2 ，临用前配制。16. 考马斯亮蓝 R250 染色液：考马斯亮蓝 R250 0.25g ， 30% 乙醇， 10% 冰乙酸，总体积
9、500ml 。17. 脱色液：乙醇 6ml ，冰乙酸 2ml ，加水至 20ml 。【器材】1. 夹心式电泳槽2. 转移电泳槽3. 电泳仪【实验材料】1. 人血清2. 硝酸纤维素膜三、实验步骤 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 灌胶前的准备 ： 将两块玻璃板洗净晾干或用吹风机吹干，嵌入本体的凹槽中，长玻板朝外，短玻板朝内，两块玻璃板之间就形成了凝胶室。合上滑块，拧螺栓锁紧凝胶室，检查凝胶室底部是否与本体底端重合。然后将以上组合放入制胶架，插入并旋转凸轮，即可灌胶。2. 配制胶液分离胶浓缩胶胶液浓度 %12%4%30% 贮备液 (ml)3.20.53分离胶缓冲液 (ml)2浓缩胶缓冲液 (ml)1
10、.0重蒸水 (ml)2.662.3610%SDS(ul)8040混匀后再加入以下试剂：10%TEMED(ul)804010 过硫酸铵 (ul)4020总体积 (ml)843. 灌 胶：将配制好的分离胶液倒入两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶液加至距短玻璃板顶端约1.5cm处时停止灌胶，然后在胶液表面上小心加入厚约 0.5cm的水层，以保持分离胶面平整，同时隔绝空气，空气中的氧对凝胶的聚合有阻碍作用。待凝胶和水之间出现清晰界面时，说明分离胶已聚合 ，大约 30min完成聚合。倾去分离胶上层的水，将配制好的浓缩胶液加到分离胶上，至接近短玻璃板的顶端，插上样品梳，放置待其聚合。4.配制电极缓冲液：甘氨酸
11、 14.1g ，SDS 0.5g ，Tris 3g ，加水至 1000ml ，pH8.3 。每组配 1000ml 。5.制样：5 l 人血清，加 45 l 水，再加 50 l 加样缓冲液。沸水浴加热8分钟， 10000rpm离心 2 分钟 ,取上清液作为样品。另按说明书制备好蛋白质分子量标准样品。6. 加 样 ：1 、加入电极缓冲液；a) 拔出样品梳；b ）选 3 个样品槽，用微量进样器加样，中间槽加入5 l 分子量标准蛋白样品，两旁槽各加入 10 l 人血清样品。稳压 120V 电泳，当溴酚蓝前沿到达距底部 0.5cm 左右时，停止电泳。7. 切 胶：根据切割线，先竖切后横切，宽胶条为两泳道
12、，含人血清样和分子量标准蛋白样，考马斯亮蓝 R-250 全蛋白染色。窄胶条为一泳道，为人血清样，转印后对目标蛋白免疫染色。8. 胶条保存 ：将两个胶条用保鲜袋包好， 贴上标有自己名字的标签 -20 冻存。转印蛋白质到硝酸纤维素膜上1. 将带有人血清和标准蛋白的宽胶带用考马斯亮蓝 R250 染色、脱色：将宽胶条放到培养皿中， 用蒸馏水清洗后， 加入约 10ml 考马斯亮蓝 R-250 染色液染色 1 小时左右，然后换成脱色液脱色，不时摇动。更换几次脱色液，至背景无色透明，条带清晰为止。2. 放置 NC 膜和胶条：a) .切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液或水浸泡5min 使之湿润。b) .准备 2 张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。c) 打开转移转移槽的胶板，依次放入： a. 一张浸湿的海绵 b. 一张浸湿的滤纸 c. 用转移缓冲液冲洗过的胶， 并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡d. 硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向 e. 一张浸湿的滤纸 f. 一张浸湿的海绵。3. 转 移：小心地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满。插好转移电泳装置的电极，打开电泳仪开关调至稳压 60V ，电泳 1h ，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。
