土壤溶菌酶提取的实验报告

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1、学术活动实验报告题目： 土壤中溶菌酶的筛选与发酵指导老师：小组成员：时期：目录摘 要 1一：实验目的1二：实验原理12.1 什么是溶菌酶 12.2 溶菌酶的应用 22.3 实验指示菌 3三：实验内容33.1 实验器材 33.2 实验步骤 4四：实验结果记录8五：实验心得体会9摘 要：土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微 生物的主要菌源。通过采用无菌操作技术，先用稀释法制备土壤的 菌悬液，然后结合选择培养基用平板划线法分离出溶菌酶，通过观 察和描述培养特征对菌株所属类群进行初步鉴定，对溶菌酶进行发 酵。关键词：土壤 溶菌酶 分离 纯化 细菌 无菌一、实验目的1. 掌握溶菌酶的生长特

2、性以及培养方法。2. 掌握溶菌酶实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术、 纯种分离技术、纯种培养技术。3. 掌握合成培养基并选择培养基的制备方法。4. 学习对微生物实验的中出现问题的分析解决方法。二、实验原理2.1 什么是溶菌酶溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或阡乙酰胞 壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一种能 水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞 壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的0-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏 多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶 解。溶菌酶还可与带

3、负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱 辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗 病毒等作用。溶菌酶存在于人体的各个组织中，如心、脏、脾、肺和肾等， 其中以肾和肺中含量最高。鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾 液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含 量最为丰富。植物中有溶菌酶， 目前已从木瓜、无花果、芜菁、大 麦等植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，约为2400029100。溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是 C 型，是已知的最耐热的酶。溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失 活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复。溶菌酶可被 冷

4、冻或干燥处理，且活力稳定。溶菌酶适宜pH5.36.4，可用于低 酸性食品防腐。溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于 G+ 菌，对部分 G­ 菌也有抑制效果。溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一 种天然蛋白质，1992年FAO/WTO的食品添加剂协会已经认定溶菌酶 在食品中应用是安全的。2.2 溶菌酶的应用2.2.1 医学应用可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病 毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻 炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可 与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口 服, 35片/次（肠溶片含10mg），

5、3次/日。口含，1片/次（口含片 含20mg），46次/日。外用：以1%2%溶液滴注、涂擦或直接喷 粉。肌注，50mg100mg/次，12次/日。滴眼：用2%溶液。2.2.2 食品和发酵工业溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作 用，因此可用作食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋 糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳 化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道 中双歧杆菌的增殖。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类 调味料等。2.2.3 副作用偶有较轻的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓 痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛

6、、抗过滤性病毒等 作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤 病及眼、鼻、喉等用药。o2.2.4 细胞工程溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理细菌可 得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合 操作必不可少的工具酶。2.3 实验指示菌金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus ) 是人类的一种重 要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus),有“嗜肉菌的 别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。所以在实验 过程中一定要严谨，不要污染实验环境。三、实验内容3.1 实验器材1. 器材：培养皿、载玻片、 量筒、滴管、吸水纸、烧

7、杯、三角 瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、 恒温培养箱、高温灭菌 锅、无菌操作台、天平、滤纸、pH试纸等。2. 试剂：指示菌培养基:Luria-Bertani(LB)培养基，蛋白胨1%,酵母膏0.5%, NaCl 1%, pH 值调至 7.2-7.4,121C灭菌 20min。初筛培养基及菌株的保存培养基: 蛋白胨 1%，牛肉膏0.5%，NaCl 1%,琼脂 1.5%-2%。pH 值调至 7.2-7.4,121C灭菌 20min。基础培养基：蛋白胨1%,牛肉膏0.5%, NaCl 1%。pH值调至 7.2-7.4,121C灭菌 20min。摇瓶发酵产酶培养基：可溶性淀粉 1.25%,牛肉膏2

8、.5%,玉米浆 1%, Tween 0.1%, pH 值调至 7.0,121C灭菌 20min。土壤稀液：5g 土壤研磨，加10g无菌水，梯度稀释10-6倍。（梯 度稀释：取lml原液加入9 ml无菌水，反复五次，即为10-6倍）3.2 实验步骤步骤一：1. 土壤的稀释： 研磨土壤，量取5g 土壤加入锥形瓶中贴标签； 加入 50mL 的水用报纸封口； 土壤溶液放入恒温振荡器中震荡20分钟； 取5个试管，分别加入900吐的水； 从锥形瓶的土壤溶液中吸取100吐的溶液滴入第一个试管中， 反复吸放几次使溶液均匀； 换枪头从第一个试管中吸100吐的溶液至第二个试管中； 反复吸上吸下几次，使溶液均匀再换

9、枪头吸100吐入第三个试 管中； 如此直至到第五个试管,然后给第五个管贴标签即为10 6的土壤 稀释液;2. 初筛培养基的配置（三组共作 200mL）： 取一个大锥形瓶，用电子称称量2.08g蛋白胨放入大锥形瓶中； 用小锥形瓶称量 1.03 牛肉膏； 在瓶中加入 50 ml 水加热用玻璃棒搅拌溶解加入大锥形瓶中； 称量NaCl1.99g加入大锥形瓶，加入50ml水摇匀后，再加100ml 水，通过分两次加水避免出现球状不溶物； 配制 NaOH 溶液，用 EP 管不断向大锥形瓶滴加 NaOH 溶液同时用PH试纸测溶液的PH直至溶液的PH值到7.27.4,之所以要这 么做是因为实验室的水是弱酸性的；

10、 加入琼脂 3.97g 加热至溶解，用报纸包扎封口，贴标签；3. 指示剂培养基的配置（三组共作 200mL）： 用电子称取 2.03g 蛋白胨加入大锥形瓶， 用小锥形瓶称量 1.01g 酵母膏加 50ml 水加热用玻璃棒搅拌溶解 加入大锥形瓶中， 称 2.01gNaCl 加入大锥形瓶，加入 50mL 水摇匀；再加 100mL 的 水摇匀（多次分量加可以使物质溶解的更快）； 用滴液管吸NaOH溶液，搅拌测PH,直至PH在7.27.4 （滴液 管保持竖直避免污染）； 称量琼脂 4.02g 加入搅拌；加热同时搅拌，加热至溶解，用报纸包扎封口，贴标签；4. 高温灭菌：将两个培养基放入高温蒸汽箱中，12

11、0 C灭菌约一个小时，其中 实际处于120 C20min，先在锅底加水，放入培养基，盖上盖子， 关闭两个排气阀，设定好时间和温度后开始加热，冷却时先旋开侧 面排气阀再拨开上面的排气阀，待锅内相对气压降为零再开盖；打开无菌操作台的紫外灯，取出来培养液放入在无菌箱中稍等 约 10min ，然后趁热未凝固倒入培养皿中，以培养皿表面铺一层为 宜，贴标签；每组初筛和指示培养基各两个，3组共计12个，晾凉，待培养 液完全凝固后倒置在工作台中以待下一步处理；5. 土壤溶液的涂抹： 点燃酒精灯，用滴液管区第五支EP管中的土壤溶液200吐滴加 在培养基上； 用酒精浸湿涂抹棒后在酒精灯上烧烤消毒，打开培养基时用酒

12、 精灯火焰烧一下开启处，用涂抹棒把培养皿盖上的水蒸气刮掉 作为冷却； 用涂抹棒将滴上去的土壤溶液做同心圆涂抹，直至培养及表面 无液体流动，抹得过程不要太用力以免刮破培养基，如果刮破 了就绕开破损处,这个过程很慢，要有耐心； 按以上步骤涂抹另外三个培养基； 完成后翻过来放入生化培养箱中进行培养12天，培养箱温度 为37 C左右。 按1g水：lg玉米配置一些玉米浆备用。 步骤二：活性检测： 将培养基取出，可以看到指示培养基上长出不少一点点的金黄 色菌落这就是金黄色葡萄球菌的菌落，初筛培养基上长出成斑片状 白色的菌落这是能分泌溶菌酶的菌落。找出菌落长得比较好的三组；将初筛的菌接种到指示菌的 金黄色菌

13、落周围；再取一些指示的金黄色葡球菌接种到初筛上 面菌落周围。接种时先把接种环浸酒精再在酒精灯火焰上烤消毒烧成红亮， 挥几下冷却，打开培养基时用酒精灯火稍微焰烧一下开启处，然后 用接种环刮一个转移菌落再在所接种目标菌落周围刮一圈就可以 了，每一次接种后都要消毒接种环并记得贴上标签。接种后再把培养基倒置放入生化培养箱中进行培养12 天。步骤三：扩大培养：将培养基取出，可以看到接种的菌落相接处金黄色菌落出现一 些溶解现象。说明活性检测成功。1. 配置发酵培养基（2组共作200mL）： 取250ml容量的锥形瓶，用电子秤称取2.5g可溶性淀粉加入锥形瓶， 称取 5g 牛肉膏加 50ml 水电炉加热溶解

14、倒入； 用漏斗、滤纸滤玉米浆于小锥形瓶中，再用EP管移2000吐到 目标锥形瓶中，过滤的过程很慢，要有耐心，不要有渣滓； 用EP管移200吐的Tween液到目标锥形瓶中，Tween液很油滑，动作要快，Tween液是作为添加剂，加水至200ml,配制NaOH溶液，不断向大锥形瓶滴加NaOH溶液同时用PH试纸测溶 液的PH直至溶液的PH值到7.0。（注意今天配的培养液和4 号配的不同，是不用加琼脂的，扎好瓶口，贴上标签）2. 配制指示剂培养基（本组 200ml）： 用电子称取2g蛋白胨加入大锥形瓶； 用小锥形瓶称量1g酵母膏加50ml水加热用玻璃棒搅拌溶解加入大锥形瓶中； 称2gNaCl加入大锥形

15、瓶，加入50mL水摇匀；再加100mL的 水摇匀； 用滴液管吸NaOH溶液，搅拌测PH,直至PH在7.27.4 （滴 液管保持竖直避免污染）； 加热同时搅拌，加热至溶解，用报纸包扎封口，贴标签；注意：今天配的培养液和4号配的不同，是不用加琼脂的。3. 高温灭菌：将两个培养基放入高温蒸汽箱中，120 C灭菌约一个小时，其中 实际处于120 C20min，先在锅底加水，放入培养基，盖上盖子， 关闭两个排气阀，设定好时间和温度后开始加热，冷却时先旋开侧 面排气阀再拨开上面的排气阀，待锅内相对气压降为零再开盖；打开无菌操作台的紫外灯，取出来培养液放入在无菌箱中，将 培养液分装入小锥形瓶中，每瓶约40ml，每种培养液每组2瓶，贴 上标签，冷却至常温。4. 接种：消毒接种环挥几下冷却后挖一个目标菌落再在扩大培养液中搅 拌就可以了