细胞凋亡实验步骤及注意事项

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1、细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死 细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡 普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定 生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自 主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆 浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进 一步融合将细胞分成多个完整包裹的

2、凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消 化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引 起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为 180-200bp 或它的整倍数的 各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder （梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即 丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎 症反应，坏死过程中细胞核 DNA 虽也降解，但由于存在各种

3、长度不等的 DNA 片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋 亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏 感程度。三尖杉酯碱（HT ）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血 病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.025pg/ml范围内作用2小时， 即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1pg/ml HT在 体外诱导培养的 HL-60 细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide PI）对细胞

4、进行双重染色，可以 区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如 PI 等不能穿过质膜。当细胞坏 死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死 细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可 跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料 且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与 DNA 特异结合(主要结合于 A-T) 碱基区)，显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。三、实验用品1、试剂：三尖杉酯碱(HT)，300|jg/ml, 100mmol/L Tris-H

5、Cl(pH7.5)，5mol/LEDTA 缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc (pH4.8 )；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1% 琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500pg/ml； Ho33342母液：2mmol/L。2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器(1ml， 100pl)0.5、 1.5ml 离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37C, 5%CO2 条件下培养。五、方法步骤1 、三尖杉酯碱诱发 HL-60 细胞凋亡(1

6、)实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记、，每瓶含约6ml 培养液，置 37C， 5%CO2 培养箱培养。(2 )实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，号瓶加入三尖杉酯碱200pl， 使终浓度为1pg/ml，号瓶中加入同等量PBS (pH7.4 )作对照。共同放入培 养箱中继续培养2.5小时。2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞(1) 染色:将瓶中的细胞摇匀取200pl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342 母液2l, PI 201，染色15分钟。(2) 滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后 的细胞悬液10pl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫

7、外激发光，高倍镜下 观察，区别三种细胞，并注意三者比例。注意 1. 诱导培养 HL-60 细胞时间要准确；事 2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。项 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。 凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细 其 胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己 他 结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和 细胞膜进一步

8、融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞 噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其 它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。 核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为 180-200bp 或它的整 倍数的各种片断。如果对核 DNA 进行琼脂糖电泳，可显示以 180-200bp 为 基数的 DNA ladder （梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早 期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物， 引起炎症反应，坏死过程中细胞核 DNA 虽也降解，但由于存在各种长度不 等的 DNA 片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱 导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对 刺激的敏感程度。