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1、HHIP基因在子宫内膜腺癌中甲基化状态及表达赵欢;冯玉珍;庞义存【摘要】Objective:To investigate the aberrant methylation and the expression of Hedgehog Interacting Protein (HHIP) gene in endometrial carcinoma,and to explore the possible relationship between the methylation of the gene and the expression of the gene and their effect o
2、n the carcinogenesis and the proliferation of the endometrial carcinoma. Methods:The promoter methylation status of HHIP gene was tested by methylation-specific PCR in 20 normal endometrium tissus and 30 endometrial carcinoma tissus. The expression of HHIP was studied by histochemistry in 20 cases o
3、f normal endometrium and 30 cases of endometrial carcinoma.The correlation between the methylation status and endometrial carcinoma , the correlation between the HHIP silencing and endometrial carcinoma as well as the correlation between the methylation status and the silencing of HHIP were tested b
4、y SPSS 13.0. Results:The frequencies of hepermethylation of HHIP in normal endometrium tissues were 0% (0/20),while the frequencies of hepermethylation of HHIP in endometrial carcinoma tissue were 40% (12/30). The methylation rate in endometrial carcinoma tissue was higher than the methylation rate
5、in normal endometrium tissue. All the normal endometrium tissues showed positive staining pattern of HHIP protein (20/20). 40% (8/20) of endometrial carcinoma tissues showed positive staining pattern of HHIP protein. In endometrial cancer, the HHIP protein silencing was easier to be found than in th
6、e normal endometrium tissue.The hepermethylation of HHIP gene was not related with the expression of HHIP protein (P 0.05). Conclusions: HHIP is related to the occurrence and the development of the endometrial carcinoma. The methylation rate in endometrial carcinoma tissue is higher than that in nor
7、mal endometrium tissue. In endometrial cancer, the HHIP protein silencing is easier to be found than in the normal endometrium tissue. The methylation of the HHIP gene promoter may be related to the silencing of the expression of the protein to some extent,and it may be involved in the occurrence of
8、 the endometrial carcinoma. However, methylation may not be the only reason for the silencing of the expression of HHIP, and other mechanisms remain to be revealed.%目的检测 HH 相互作用蛋白(HHIP)基因 在子宫内膜腺癌中的异常甲基化状态、其蛋白表达情况及两者的关系,探讨其在子 宫内膜腺癌发生、发展过程中的作用机制.方法:收集子宫内膜腺癌新鲜组织标本30 例和正常子宫内膜新鲜组织标本20例应用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-P
9、CR) 方法检测HHIP基因的甲基化状态，并采用免疫组化法检测HHIP蛋白的表达情况， 比较子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织HHIP基因甲基化状态、HHIP蛋白的表 达情况，并分析HHIP基因甲基化与蛋白表达的相关性.结果:20例正常子宫内膜癌 组织均为非甲基化状态，甲基化率为0(0/20),30例子宫内膜腺癌组织中，有12例发 生了甲基化，甲基化率为40%(12/30),子宫内膜癌的甲基化率高于正常子宫内膜(P 0.05) ; HHIP蛋白在正常子宫内膜组织的表达均为阳性，表达率为100%(20/20), 在子宫内膜腺癌组织中阳性表达率为40%(8/20),子宫内膜腺癌组织中存在HHIP 蛋
10、白的表达缺失情况，两者差异具有统计学意义(P 0.05).子宫内膜腺癌组织中甲基 化阳性与甲基化阴性组织中HHIP蛋白表达率比较，差异无统计学意义(P=0.670). 结论:在子宫内膜腺癌中存有HHIP基因启动子区甲基化现象，并且存在HHIP蛋白 表达的沉默；HHIP基因启动子区甲基化并非导致HHIP蛋白表达缺失的唯一因素, 可能有其他机制导致子宫内膜腺癌中HHIP蛋白表达沉默.【期刊名称】国际妇产科学杂志【年(卷)，期】2013(040)001【总页数】5页(P97-99,102,封3) 【关键词】子宫内膜肿瘤;腺癌;甲基化;免疫组织化学;聚合酶链反应 【作者】赵欢;冯玉珍;庞义存【作者单位
11、】050000石家庄，河北医科大学第三医院妇产科【正文语种】中文Hedgehog( HH)信号通路系统在低等动物到高等动物中普遍存在1，是一 个进化保守的信号通路。HH信号通路在动物胚胎时期器官形成、细胞分化以及细 胞增殖中起着关键性的作用2。许多研究表明，在成人阶段HH信号通路的过 度激活与许多肿瘤的形成有关。HH相互作用蛋白(hedgehog interacting protein , HHIP )是HH信号通路的转录靶点，也是HH信号通路负反馈调节的 个关键因子，能阻止HH信号通路的过度激活3。HHIP mRNA在正常的组 织中有表达4,而在一些肿瘤组织中表达降低。研究发现，在肝癌、胃肠
12、道恶 性肿瘤、胰腺癌、成神经管细胞瘤中HHIP表达降低原因可能是HHIP基因启动子 CpG岛的甲基化3,5。本研究探讨子宫内膜癌中HHIP基因甲基化及其表达 情况。1材料与方法1.1 一般材料收集河北医科大学第三医院2008年1月一2011年2月因子宫内膜 腺癌行子宫切除术的标本30例，术后均得到病理确诊，全部病例术前均未作化疗、 放疗和免疫治疗。收集本院同期因子宫肌瘤行子宫全切术患者的正常子宫内膜标本 20例。1.2主要试剂免疫组织化学HHIP 一抗（sc-25465）购自SANTA CRUZ公司， Wizard DNA Clean-up system 以及 GOTaqHotStartPol
13、ymeras。购自美国 Promega公司。HHIP甲基化及非甲基化上下游弓物由上海捷瑞生物工程有限公 司合成。1.3主要仪器美国MJ公司PTC-220型梯度基因扩增仪、北京六一仪器厂DYY- 12型电脑三恒多用电泳仪、法国VL公司BIO-PROFIL型凝胶成像分析系统2155 型石蜡病理切片机、德国Leica TP1020型病理组织脱水机。1.4方法1.4.1标本制备及保存30例子宫内膜癌标本以及20例正常子宫内膜标本均分为2 份，其中1份于-80OC保存备用（用于提取DNA），另1份标本经10%中性甲醛 固定备用（用于免疫组化）。1.4.2甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR ）检测1.
14、4.2.1组织DNA提取取新鲜组织，用5 mL TE缓冲液由10 mmol/L Tris- HCl和1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA ）配制清洗5 min。加组织消化液 0.5 mL匀浆。加入蛋白酶K （ 20 g/L ）溶液12.5 pL,55C震荡加热6 h。 加入等体积抽提液（酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1 ），混匀离心，收集上 层水溶液并重复抽取。加1/10体积的3 mol/L醋酸钠（pH = 5.2 ）和2.5倍体 积的无水乙醇，倒置混匀，4C12 000 r/min,离心20 min，弃上清液。加75% 乙醇1 mL , 12 000 r/min，离心10 min，弃
15、上清液。沉淀干燥后TE液溶解，4C 过夜，-80OC保存备用。基因组DNA用经紫外分光光度计检测纯度， A260/A280 均在 1.8 2.0 之间。1.4.2.2基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰参照文献 6:DNA变性：取2凹基因组DNA，加灭菌双蒸水至18 ”，95C加热变性10 min，立即冰浴5 min。加入3 mol/L NaOH 2 pL,42C水浴变性20 min。碱基修饰：向碱变性的基因组DNA中加入5 mol/L Na2S2O5处理液 (pH = 5.0，含125 mmol/L对苯二酚)380 ,混匀，脉冲离心，加入200 pL石蜡油，50C加热12
16、 16 h。脱盐回收：加热完毕后，吸出石蜡油，加纯化 液1 mL,混匀，静置10 min , DNA纯化柱除盐，将DNA洗脱至50 pL超纯水 中，室温放置10min，离心。脱去磺化基团：加入3mol/LNaOH11pL,37C 水浴箱15 min终止还原反应，加入83 pL 10 mol/L醋酸氨及2.5倍体积的预冷 无水乙醇沉淀，-20C过夜沉淀。次日，12000r/min，离心20min，弃上清后， 加入70%乙醇200pL洗沉淀，12000r/min，离心10min，弃上清。干燥后，将 DNA溶解于50pLTE缓冲液(pH=7.5 )中，-80C保存备用(避免反复冻融)。1.4.2.3 MS-PCR扩增弓物序列参照文献7，非甲基化上游弓物序列为：5- AGTAGTTGGGTAGTTTTGGAATTTTTGG-3，非甲基化下游弓物序列为：5- AAAAACAACTAACCACAACA-3；甲基化上游弓I物序列
