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1、word世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版 精华序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why.为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面里的文献另外，
2、成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子无需叮当:/ dxy/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3 本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。1.材料选择。一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。2，培养基选择neurbasal
3、/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。我强烈不建议用血清培养。原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要参加阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。需要的添加剂为 B27和谷氨酰胺。培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。其中，ne
4、urobasal是胎鼠培养基，而-A为新生鼠培养基。不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。注意！由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金，血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加冰上预冷。这就意味着，从你处死母鼠后，
5、胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度。另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要2小时，如果样品多。一定要注意多准备冰袋子。确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进展消化步骤除外。这样可以大大提高存活率。在解剖大脑时候，有人用hanks，在其中解剖。根据我的经验，即使是0度，神经元还是在进展着很大程度代谢。所以，hanks的无糖环境很不利。我个人建议，用DMEM-高糖或DMEM-F12+马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供应大脑的代谢，血清可以抑制神经凋亡。这其中还有一个问题，就是DMEM培养液会在空气中变碱性。国外有的实验室用L-15培养液来浸泡解剖过程中的脑，因为L-15不
6、会再空气中变碱性。没有L-15的(国内几乎没有，可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖过程中的脑。注意注意：一切操作都在冰浴的液体中，所以要多准备冰袋。中途冰袋没了的是猪头4.关于培养皿的问题。一般来说，6孔板是最优选择。神经元让人苦恼的问题是，神经元发育的情况和密度相关。大于6孔板比如6CM DISH会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成板中间和边缘成熟度不一样，而这会给实验带来很大干扰。而太小的话96孔或128孔细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。所以笔者经验是6孔板是最优选择。神经原代培养一定是要包被，用POLY-LYS或者胶原。关于POLY-LYS包被，我们
7、是包被30分钟，吸干晾过夜，然后洗两次，或者只洗一次但是要30分钟接着晾干。由于neurobasal培养法相当成熟，所以没必要用难固定的胶原。5.处死母鼠并把胎鼠解剖时候，一定要注意母鼠状态，是否有死胎，胎儿胎盘是不是正常，有多少胎，母鼠是多少天的一般是E16-E18这些信息也要严格记录。处死孕鼠后，要立即取出子宫放入冰冷培养液中。注意孕鼠处死后要短暂的浸泡酒精消毒，防止污染。一般来说，冰袋笔者选择一面蓝一面白的。蓝的朝上，可以很清晰看到海马结构。而去除血管膜的时候，白的那面朝上，这样可以很清楚看到血管膜。从处死老鼠到大脑被剥离出这段是人就会做，我就不多说了。不过有一点要注意，不管你是用皮层还
8、是海马，不要取一个别离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到冰预冷的培养液中。我建议胎鼠取出来的时候胎鼠就放在冰冷的缓冲液中。就是说，处死后要迅速把大脑的温度降到0.6：最影响原代培养的成败因素之一：这小段请大家一定注意看。无论皮层还是海马，上面都是有一层血管膜。注意：一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。可以用解剖显微镜。胎鼠很好剥离，而新生鼠如此比拟难。这里千万不能粗心大意！血管膜没剥离干净的后果是：1 吹打时候很难吹打下来神经元，被迫屡次吹打，造成神经元大量死亡；2 血管膜一局部细胞会混入原代培养中，这些细胞往往会分裂，导致你的培养成果根本不能用。可以说，剥离的不好不干净，实验就是
9、失败的，不可能得到高质量的神经元。注意的事情二：如果是要的是皮层的神经元原代培养，而皮层的细胞很多，切忌不要放太多皮层消化吹打！过多的细胞反而会导致神经元大量死亡。另外，请仔细注意文献中要的是皮层哪一部位。没有详细要求的话一般是取顶端。从大脑到单个海马的剥离我不细说了。我现在以海马神经元为例。在所有海马都成功剥离后，请仔细的去除血管膜，原因上面说过。最后，请再仔细检查一下是不是都去掉了。确认后，海马片段被移入一个小烧杯里，加少量培养液，用剪刀剪成0.5-1立方毫米的小块，放置冰上准备消化，7：实验成败的关键之二：消化。一般来说，我看很多人都用0.125%的胰酶消化。实话说，胰酶消化非常的难以掌
10、握速度，而且消化效果真的是-很烂！稍微不注意，就会消化过头，细胞都消化光了。而胰酶消化的快，还会出现细胞快速破裂释放出DNA，和其他蛋白缠结成絮状包裹在组织块外面，使得块里面的不到应有的消化。所以我个人不推荐胰酶。想做一个完美成功的消化，我强烈推荐木瓜酶+DNA酶。木瓜酶是消化过后，存活率最高的酶见附图。笔者是配成2mg/ml的木瓜酶。另外要用的是DNA酶。DNA酶的作用是，消化掉破裂细胞的DNA，防止了释放的DNA和蛋白缠结在组织块外表而阻碍进一步消化。DNA酶由于各个公司的活性不一样，很难有标准浓度，需要摸条件，不过不是很严格，只要能防止DNA缠结就好。木瓜酶的特点是不会消化过头，非常温和
11、。缺点是一定要现配请直接用无血清的培养液配来保证神经元的营养代谢，而且一定要现用现配。消化的技巧：消化时候，很多人有不良习惯，喜欢用个50ml试管装着所有东西。结果是组织都沉底，下面消化不足，上面消化的没细胞。笔者的技巧是，用一个6或10CM 培养皿来消化。这样消化液在培养皿里形成浅而广阔的一层，均匀分布着组织块，从而彻底解决了上述问题。消化酶是2mg/ml木瓜蛋白酶+适量DNA酶。木瓜蛋白酶很廉价请放心。消化过程是20-30分钟。由于木瓜蛋白酶温和，因此不会消化过头，使得你的实验消化的很稳定。消化时候请在37度温箱里，每5分钟稍微摇动一下。注意：1木瓜酶不要用巯基化合物激活，激活后消化好很多
12、但是成活率坏很多；2尽量用不含血清的培养液来配置木瓜酶而不是用hanks，使得神经元保持营养；3木瓜酶一定要现用现配。再次重申：除了消化过程中要37度，其余任何时刻都是要浸泡在0度冰浴的液体中。消化过后可以用1ml血清终止反响我是用马血清，廉价，但是切忌不要用国产血清，污染几率很大。把消化用的培养皿放在冰上冷却，然后垫高一面使得液体集中在另外一面便于吹打。整个体系静止2-3分钟，然后仔细的去掉上层的液体，保存消化过的组织块8.实验成败最关键最关键的：吹打。笔者经验是，没有必要用巴斯德管。对于胎鼠和10天之内的新生鼠，一般的1ml蓝枪头就可以达到满意的效果。在一边被垫高的皿里面，参加1-1.5m
13、l新鲜培养基和少量DNA酶，吹打10次。吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。轻柔吹打是细胞成活关键！要用进口枪头，国产的有时候会过细。我们采用的是最合理的分步吹打法。每个10次吹打过后，静止2分钟。这时候游离的单细胞在上面，而团块会沉到下面去。上面的那层就是你要的单个悬浮细胞，把它们挪到指定容器里一样要冷在冰上。下面沉淀下去的细胞团块不要丢弃，再加1-1.5ml新鲜培养液，重复刚刚的步骤，轻柔吹打，再静止2分钟，转移上层的单细胞到刚刚指定容器里，一共这样分步吹打3次。3次之后如果还有团块在下面，请果断丢弃。造成这个的原因就是刚刚的血管膜没剥
14、好。这个分步吹打的过程保证了每一个单细胞都防止了过度吹打，而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细胞。重申一下，为了保证最大程度收获活细胞，每次吹打之前，可以参加少量DNA酶。这招可以更容易收获大量高质量细胞，尤其是实验材料不足时候。消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多，这样反而会使大量细胞死亡。实验者如果是用的皮层这种原材料充足的话，切忌不要放入过多皮层。9可选可不选，但是我建议全选神经元进一步纯化。 一般来说，收获的细胞悬液已经是很纯的神经细胞了。但是，由于实验者等个人或者客观原因，血管膜可能不会被完全剥离；杂细胞可能也被吹入了细胞悬液；操作者手法不熟练，造成死细胞过多，影响种板等等原因，还是会影
15、响到培养的神经元的质量。为了克制这些，笔者查了一些文献，经过反复测试采用了nycoprep低转速密度-梯度离心。现在这个梯度溶液已经被公司升级为optiprep.稀释时候，NycoPrep 1.077 推荐稀释成 60%，就用刚刚悬浮细胞的培养液来配置。注意：1.077被广泛应用于血液中别离血细胞，如果你拿到的nycoprep(optiprep)不是1.077，那么请换算一下稀释度值得注意的是，皮层和海马可能需要的稀释度稍微有不同。一般来说，一个10ml梯度离心管中，2-4ml稀释过的梯度液体就够用，取决于你收获的细胞量多少。把你收获的细胞悬液小心的加到稀释好的梯度剂的上面一层，经过1500转
16、不是15000请注意5-8分钟，神经元被高度压缩到梯度面和上面的培养液分界面那一层。而最下面的梯度剂下的沉淀如此是细胞团块，血细胞，杂细胞，以与局部小胶质细胞。而最上层最浮头，如此是细胞碎片。这样，你就得到了最大限度去除了杂细胞，和细胞碎片，并去掉了一定的胶质细胞的最干净最纯粹的神经元。如果实验者技术精湛，也可以不用这步，但是用这步会效果更好。注意：母液稀释到60%只是参考，具体实验室不同可能略微有差异，要摸条件而不是死记硬背。另外皮层和海马浓度也稍微有差异。有些文献曾经报道，在梯度一定的情况下，一些特定梯度可以分开神经元和少突和其他胶质细胞，但是笔者从来没成功过。10.种板。这一步没有那么非常重要，但是如果没认真弄，浓度的不均一也会使得整个实验失败。记住的是，神经元原代培养是细节决定
