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1、细胞凋亡的检测方法 细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物 化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多， 下面介绍几种常用的测定方法。1、细胞凋亡的形态学检测：根据凋亡细胞固有的形态学特征，人们已经设计了 许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。a、光学显微镜和倒置显微镜观察：未染色凋亡细胞体积变小、变形，细胞膜完 整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱 落；染色凋亡细胞常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色 质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。b、荧光显微镜
2、和共聚焦激光扫描显微镜：一般以细胞核染色质的形态学改变来 评判细胞凋亡的进展情况，常用的DNA特异性染料有：有HO 33342(Hoechst33342),HO 33258(Hoechst33258),DAPI。三种染料与 DNA 的结合是 非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。Hoechst是与DNA特异结合的活 性染料，储存用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度一般为 2-5ug/ml。DAPI为半通透性，用常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水溶解为 浓度1mg/ml，使用终浓度一般为0.5-1ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞 核染色质的形态学改变分为三期：
3、I期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；IIa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘 化；IIb期细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。c、透射电子显微镜观察。结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡I 期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象(cavitations )的空泡结 构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。2、磷脂酰丝氨酸外翻分析：磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyllserine.PS)正常位于 细胞膜的内侧，但在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴 露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量
4、为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结 合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE) 或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显 微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料， 它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞 膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的 及死细胞区分开来。方法：a、悬浮细胞的染色：1、将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5x106)用PBS 洗 2 次，加入 200plBind
5、ing Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V(20ug/ml)10pl 及 PI(50ug/ml)5|jl,室温避光30min，加入400|jlPBS，立即用FACScan进行流式细胞 术定量检测(一般不超过1小时)，同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作 为阴性对照。11、贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色 和分析同悬浮细胞。III、爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光 显微镜进行观察。结果及注意事项：整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞； 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一个小时内检测；3、线粒体膜势能(Tmt)的检测：多种
6、细胞凋亡诱导不同的细胞凋亡时，皆 发生线粒体跨膜电位mt的下降，并且发现mt下降是细胞凋亡级联反应 过程中最早发生的事件，在细胞核出现凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)之 前，还发现一量线粒体mt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的 存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine odideDiOC6(3)echloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methylester(TMRM)等可结 合到线粒体基质，其荧光
7、的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。方 法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1|jM)终浓度为 DiOC6(25|jM),JC-1(1|jM),TMRM(100|jM),37C平衡 30min, 流式细胞计检测细胞的荧光强度。结果及注意事项：始终保持平衡染液中PH值 的一致性，因为PH值的变化将影响膜电位。与染料达到平衡的细胞悬液中如果 含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。4、DNA片断化检测：细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩，染色 质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成50-300kbp长的DNA
8、大片断或 180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA后，进行琼脂糖凝胶和 漠化乙啶染色，在凋亡细胞群中则可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很 少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT) 使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。 a、大分子染色体DNA片段的测定:细胞凋亡的早期，染色体断裂成为50-300kbp 长的DNA大片段，所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的 迁移速度相同。线性DNA的双螺
9、旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。 此时凝胶不再按分子量大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一凋指向 电声一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为爬行。因此，细胞凋亡早期产生的 50-300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常彩脉冲 电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电 场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴 向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间 就越长。当DNA分子变换方向的时间小电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量 大小分开。b、DNA ladder测定：方法
10、:收获细胞(1x107)沉淀一细胞裂解液一 13000rpm,5min，收集上清一 1%SDS 和 RnaseA(5mg/ml)56C,2h一蛋白酶 K(2.5mg/ml)37C,2h1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀 DNA,4C过夜一 14000rpm,15min最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA loading Buffer 1.2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色并照相。C、凋亡细胞DNA含量 的流式细胞计分析：方法：收集细胞一70%冷乙醇(in PBS) 4C固定过夜一PBS 洗涤，1000rpm,10minRnase A(0.5ug/ml)37C消化 30mi
11、nPI(50ug/ml)染色， 室温避光15minFACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。D、 ApoalertTM LM-PCR Ladder 检测：参考 COLNTECH 提供的方法。5、TUNEL法：细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘 性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物 素形成和衍生物标记到DNA的3-末端，从而进行凋亡细胞的检测。这类方法称 为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labelin
12、g,TUNEL）。由于正常的 或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染 色。TUNEL法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个 凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确反应细胞凋亡典型的生物化学和形 态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离 的细胞的形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被 广泛采用。6、Caspase-3活性的检测：Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重 要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中 发挥功能。Caspase-3正
13、常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早 期阶段，它被激活，活化形式的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚 基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物。在细胞凋亡的晚期和死亡细胞， Caspase-3的活性明显下降。a、Western blot分析测定：Caspase-3的大小亚 基及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose） polymerase,PARP等的 裂解。b、荧光分光光度计分析：方法：收获细胞正常或凋亡细胞一PBS洗涤一 抽提细胞裂解液一加Ac-DEVD-AMC（Caspase-3四肽荧光底物）一37C反应1h- 荧光分光光度计（p
14、olarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长 为430-460nm）。c、流式细胞术分析：方法：收获正常培养或凋亡细胞一PBS 洗涤一加Ac-DEVD-AMC37C反应1h-UV流式细胞计分析Casspase-3阳性细 胞数和平均荧光强度。检测细胞凋亡的实验方法比较 TUNEL与ELISA检测凋亡的方法比较TUNEL法细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核 糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶 或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧
15、核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因 而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法， 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形 态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形 态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.ELISA法测细胞凋亡细
16、胞凋亡时，Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断， 产生单或寡合苷酸小体，各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内 源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直 接检测DNA和组蛋白。几种检测凋亡的方法一、形态学观察方法1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面 有出芽”现象。2、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞 核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果 细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性， 区别坏死细胞有一定的帮助。4、透射电镜观察：
