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1、生物活性参L与化学发光生物发光第十二章分子发光分析法发光：基态分子吸收能量（电能、热能、化学能或光能 等），电子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态返 回基态时，以发射电磁辐射（即光）的形式释放能量。电能c电致发光、 化学能化学发光荧光房支+ 光能 T2 Sx Tj So激发态（洪特规则）L M t t基态 -1 基态激发围重态激发三重态T电子自旋状态+ I北京化工大学北方学悦3KH院第一节分子荧光磷光产生基本原理三、激发态到基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时， 通过辐射跃迁（发光）和非辐射跃迁（热）等方式失去能量。传递途径/辐射跃迁非辐射跃迁荧光延迟荧光I磷光系间跨越11
2、内转换I I外转换11振动弛豫返回速度快的途径，发生几率大!第一节分子荧光磷光产生基本原理hv（一）、非辐射跃迁1 .振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动 弛豫的时间S2北京化工大学北方学陵3K工虎第一节分子荧光磷光产生基本原理2 .内转换：相同多重度的电子能级中，相等能级间的 非辐射能级交换。发生内转换的时间g 第一节分子荧光磷光产生基本原理3 .系间跨越：不同多重态在有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，通过自旋一 轨道耦合等跃迁。北京化工大学北方学噫砒工吃第一节分子荧光磷光产生基本原理4.外转换：激发态分子与溶剂或其他
3、分子之 间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射 跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭” O（二八辐射跃迁1 .荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能 级T基态各振动能级，发射时间约为107109。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。s2北京化工大学北方学府砒工院第一节分子荧光磷光产生基本原理2 .磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能 级一基态各振动能级。发光时间：104100s。So 一激发态一振动弛豫一内转换一系间跨越振动弛豫Tl 一 So第二节荧光光谱与基本特征一、荧光激发光谱二、荧光发射光谱三、荧光光谱的基本特征北京化工大学北方学BE 3K工虎第二节荧光光谱与基本特征一
4、、荧光激发光谱固定荧光波长 改变激发光波长， 测定不同波长的激 发光激发所得到的 荧光强度与激发光 波长曲线。激发光谱相当于荧光物质的吸收光谱。第二节荧光光谱与基本特征二、荧光发射光谱固定激发波长 ,扫描发射波长， 测定化合物发射的 荧光强度与不同发 射波长曲线。发射光谱的形状与激发波长无关。北京T匕工大学北方学噫砒工院第二节荧光光谱与基本特征三、荧光光谱的基本特征（一）、Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。产生原因：1 .振动弛豫及内转换，产生位移主要原因；2 .基态不同振动能级间振动弛豫至最低振动 能级；3 .外转换。第二节荧光光谱与基本特征（二）、发射光谱的形状与激发波长无
5、关荧光分子吸收不同波长的能量，电子跃迁 到不同激发态能级，产生不同吸收带，但都通 过无辐射跃迁方式回到第一激发单重态的最低 振动能级再跃迁回到基态各振动能级，产生波 长一定的荧光。北京化工大学北方学 配 3K工院第二节荧光光谱与基本特征荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发 光谱形状一样）成镜像对称关系。250330400500 A/nm蕙的乙群溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）图一、分子产生荧光必须具备的条件二、化合物的结构与荧光北京化工大学北方学噫3KH 昵第三节荧光产率与分子结构的关系一、分子产生荧光必须具备的条件1 .具有合适的结构：通常是含有苯环和稠
6、环的刚 性结构的有机分子；2 .具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：衡量荧光物质发光能力。它表示激发分子发射出荧光（或磷光）的比例。发射的光量子数(Df =吸收的光量子数发射荧光的分子数咤=被激发的分子数北京化工大学北方学虎现工虎第三节荧光产率与分子结构的关系量子产率:k,=Kic + K【sc + Kq荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速 率常数有关，可用各过程的速率常数来表示受光各种无辐射跃迁过程的速 率常数之和.取决于分子 所处的化学环境，同时也 与化学结构有关。荧我射过程的 速率常数，取决于务H瑶构。J二、化合物的结构与荧光（一）、跃迁的类型乃上一兀对于有机荧光物质：n 一/
7、niax 7T* max104平均寿命10,10.9S 一 T速率向sc小。九*一万是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。北京化工大学北方学虎就工昵第三节荧光产率与分子结构的关系（二）、共朝效应产生荧光的有机物质，都含有共辑双键体系,共朝体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向移动。化合物量子产率。F九(nm)4m（皿）苯0.11205278案0.29286321意0.46365400丁省0.60390480（三）、刚性平面结构1 .减少分子振动，减小外转换。2 .增大分子吸光截面，增大摩尔吸光系数。（三）、取代基效应1 .给电子取代基加强荧光-HN2, -NHR , -NR2, -OH, -OR
8、 , -CN产生 共朝2 .吸电子取代基减弱荧光-C=O, -COOH , -NO2跃迁，摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系 间跨跃较大，同样使荧光减弱，相应磷光增强。北京化工大学北方学噫现工院第四节影响荧光强度的环境因素一、溶剂 二、温度 三、溶液的pint八内滤光作用与自吸现象五、荧光猝灭一、溶剂主要表现为溶剂的极性、氢锭、配位键的形成 对化合物的差光发生变化.行一九跃迁类型：激发态极性比基态大，溶剂极 性增大，跃迁能量降低，发生红移，荧光增强。溶剂与焚光分子形成氢键、配位键主要影响荧 光分子的存在型体、电离状态，荧光强度和形状均 发生很大变化。北京化工大学北方学嗨3K工院第四节 影响荧光强度
9、的环境因素二、温度温度升高，外转换的几率增加。荧光强度降低。三、溶液的PH值不同PH值下，荧光分子存在形式不同。四、内滤光作用与自吸现象内滤光作用：溶液中含有能吸收焚光物质 发射的荧光的组分，如色胺酸中的重辂酸钾。自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波 长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸 收；如意化合物。北京化工大学北方学忱3K工院J 第四节影响荧光强度的环境因素五、荧光猝灭荧光分子与溶剂分子或者其他分子之间存在 相互作用，使得荧光强度降低或消失的现象。（一）、碰撞猝灭动态猝灭M* + Q M + Q +热量激发态分子（二）、生成化合物的猝灭-静态猝灭基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的
10、 化合物，导致焚光的猝灭.M + Q -MQ（三）、氧的猝灭氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复 杂，可能包含着多种机理。北京T匕工大学北方学院砒工配,第四节影响荧光强度的环境因素（四）、自猝灭荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低。自猝灭可能有如下几个原因：1 .荧光物质分子之间的碰撞能量损失；2 .荧光物质的自吸收；3 .荧光物质分子的缔合。此外，还有电荷转移猝灭，光化学反应猝灭等。Cary Eclipse荧光分光光度计荧光、磷光化学/生物发光美国瓦里安技术中国有限公司北京化工大学北方学隗现工院第五节分子发光光谱仪结构流程一、荧光分光光度计结构流程二、磷光分光光度计结构流程一、荧光分光光度
11、计结构流程激发单色器发射 单色器检测器IJf数据处理仪器控制北京化工大学北方学虎现工阮第五节分子发光光谱仪结构流程组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器。 特殊点：两个单色器，光源与检测器通常成直角。（一）、激发光源 筑灯、高压汞灯，染料激光器。（二）、单色器激发单色器：选择激发光波长，用以分离出所需用的激发光。发射单色器：选择差光发射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、 拉曼光和杂质所发射的荧光。北京T匕工大学北方学噫砒工昵第五节分子发光光谱仪结构流程（三）、样品池 样品池四面透光。（四）、检测器 光电倍增管。检测器的方向与激发光的方向成直角，以消 除样品池中透射光和杂散光的干扰。二、磷光分光光
12、度计结构流程通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内, 来测定低温磷光。北京化工大学北方学噫砒工院第六节定量分析方法一、定量依据二、定量方法第六节定量分析方法一、定量依据荧光强度If正比于吸收的光强度4和荧 光量子产率：I （T）/ a由朗伯-比耳定律得:Ia = I.-It = I-bc)荧光强度3If =(1-10-应)=(1 - e2303sbc )北京化工大学北方学噫3KH 院第六节定量分析方法对于稀溶液，当功C v 0.05If =2.3030/。以。7r一荧光强度Io -入射光强度0厂一荧光量子产率b吸收光程-摩尔吸光系数C-物质浓度If = KC（磷光eGCvO.Ol ）时：/ =2.303/（声人。ip -磷光强度入射光强度0P-磷光量子产率 b 吸收光程-摩尔吸光系数C-物质浓度I =KCp第六节定量分析方法定量方法标准曲线法:直接荧光标准曲线法比较法：
