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1、第四篇免疫组织化学一、免疫组织化学的定义：（一）什么叫免疫组织化学？简单地说，用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原 或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部 位。目前免疫组织化学作为病理诊断，鉴别特殊病例，是不可缺少的最重要的手段，国内在 免疫组织化学的应用方面已经普遍地展开并扩展至基层单位，为病理事业做出应有的贡献。 抗原（抗原，AG）它是一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质。1）抗原的性质 异物性。它是抗原所具有的特性，机体对进入体内的某些异物，异体大分子物质可产生 免
2、疫应答。目前生物制剂公司利用这一原理生产出许多适合于临床诊断的抗体。但是，并非 所有的异物都是抗原。例如矽尘等一些生物性高分子聚合物，它们不会刺激机体的免疫系统 产生相应的抗体物质，而只是肺对吸入的矿物性和有机粉尘的非肿瘤性反应1。矽肺是肺 吸入矽颗粒沉积的结果，也是机体对另一种外来物反应的结果。 理化性状。凡具有抗原性的物质，其分子越大，它的免疫原性就越强。具有抗原性的物 质，其分子量都较大，起码在一万以上，抗原分子量越大，其相应的表面积也越大，接触、 碰撞免疫细胞的机会就增多，这犹如一颗大树，根深叶茂，占据着大片空间，不易被风刮跑。 抗原性物质由于分子量大，盘踞着较大地方，在体内存留着一定
3、的时间，时间越长，其对机 体的刺激作用就越强。 特异性。各类抗原物质结构繁琐，组成的化学结构也很复杂，但是能够刺激机体并与抗 体发生结合反应的化学组成，仅仅是抗原物质表面的一些具有活性的化学基团，化学结构及 空间构型，称为抗原决定簇。即一种抗体只能与相应的抗原起反应而不能与其它的抗原起反 应2,这就是抗原的特异性，称之为特异性抗原。虽然如此，特异性抗原也只是相对的， 因为人们希望这种特异性抗原只存在于某种细胞及结构而不存在于其它细胞及结构的特有 抗原3,但至今为止,仅发现较为狭小范围的特异性抗原，如前列腺特异抗原（Prostatespecific 抗原,PSA），它是由前列腺上皮细胞合成的一种
4、糖蛋白，目前认为是具有特异性的肿瘤标记 物之一，它可以用于前列腺癌和转移性前列腺癌的诊断，但不能用于同源的前列腺肿瘤的良 恶性诊断，因为它还不是非常特异性的抗原，前列腺增生的上皮也可以呈阳性反应。另外， 不同的抗原物质常含有共同的抗原成份，即一种抗体可与二种以上不同抗原发生反应，这些 抗原称为共同抗原2。2）抗原的类型 肿瘤相关抗原。所谓相关抗原，指的是抗原量的差别，某种抗原大量地存在于某种细胞， 但也少量或微量存在于其它细胞3。如细胞角蛋白，它不仅存在于上皮细胞中，也存在于 上皮来源的肿瘤中。在判断鉴别这方面的肿瘤时，要特别地小心，不要以为凡是阳性的细胞，都是属于肿瘤细胞， 要有区分主要细胞
5、和非主要细胞的能力，所谓主要细胞是指能给作出诊断的细胞，这些细胞 免疫组化显示阳性才算真正的阳性，其它反应性细胞即使显示阳性，在诊断上也只称为阴性。 分泌抗原。这类抗原主要分布于具有分泌功能的细胞里，这些细胞的内质网可合成分泌 抗原的前身物质，经高尔基体内组装，以分泌颗粒的形式存在于胞浆中，并随着细胞的分泌 功能排出细胞外。如腺泡上皮的酶原颗粒、粘液细胞的粘液颗粒以及内分泌细胞和神经内分 泌颗粒3。 吞沉抗原。这类抗原并非某一组织细胞的固有的结构抗原，它是机体内的活动所形成的 最终结果。例如机体内的吞噬细胞将进入体内的异物、细菌、病毒进行吞噬；g、补体、抗 原抗体复合物在通过血管及毛细血管后，
6、在肾小球基底膜上沉积下来；肾病综合征可见的系 膜增生和IgM的沉积；弥漫性系膜增生性肾小球肾炎有IgM和C3沉积；膜性肾小球肾炎 有 IgG、C3、IgM、IgA 沉积等。3）必须对抗原进行纯化（二）为了获得理想的抗体，使免疫组化技术达到定性可靠和定位准确的目的，不论是哪 一种抗原，当被用作免疫组织化学反应时，都必须进行纯化，以排除杂质。否则，将会产生 非特异性染色，有时微量的杂质也可导致产生大量的抗体。因此，用纯化的抗原制备抗体， 才能获得特异性抗体。但是，尽管使用高特异性抗体进行免疫组织化学染色，仍会有共同抗 原决定簇所造成的非特异性染色3。抗体（抗体，AB） 机体的免疫系统受到抗原刺激后
7、，通过机体一系列的化合作用：即体 液免疫应答、B淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发 生特异性反应的球蛋白的物质称为抗体。1）抗体的基本结构抗体的化学结构是由二硫键以共价和非共价的形式联结组成，呈“Y ”形，其中两条长链由450550个氨基酸组成，称为重链（Hesvy链,H）,两条短的称为 轻链（光链丄）由214个左右的氨基酸组成。2）抗体的H和L具有可变的部位抗体的“Y”形分叉端（N端），L中约1/2氨基酸和H中1/31/4氨基酸，其组成及排列顺序 随结合抗原特异不同而有所改变，故称可变区，抗原与抗体的结合取决于此区。H的2/3 3/4和L1/2处，其氨基酸的排
8、列比较稳定，称为稳定区，该区与免疫球蛋白结合补体或巨噬 细胞等生物学活性有关。3）抗体易被水解的区域抗体的铰链位于H、CH1和CH2之间，此区结构松散，易被蛋白酶水解，当用胃蛋白酶水 解时，抗体分子可得到保持有抗体结合抗原双价活性的F（ab）2片段。惊人的和F（ab）2片段 均有抗体活性。4）具有产生相应抗体的功能抗体具有各自不同的氨基酸排列和三维结构，故对于任何不同结构的抗原，机体 的免疫系统都能产生与之相应的抗体。目前，世界许多公司利用这一原理，生产出许许多多 适合于临床诊断、预防和治疗的抗体。最早制备抗体的方法是将某种天然的抗原经各种途径 免疫动物。 多克隆抗体（Polyclonal抗体
9、，PCAB）。抗原进入机体后，刺激了免疫系统，成熟的B 细胞克隆受刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。当将这些血清收集起来，便可获得抗体。 但是此类抗体成份较多，是多种单克隆抗体的混合物4，因此PCAB是跟抗原的多个决定 簇起反应的结果，故称多克隆抗体。在二十世纪八、九十年代，使用的抗体多为PCAB，女口： CEA、GFAP、NSE、CK、S 100等，于它的不均一性，限制了对抗体的进一步研究和应 用。为了进一步的开展工作，研究均一的抗体势在必行。 单克隆抗体（Monoclonal抗体，MCAB。指只能跟抗原中的某个决定簇起反应而获得的 抗体称单克隆抗体。1925年化妆墨和Milstein首次使
10、用B淋巴细胞杂交瘤技术生产出均一 性的MCAB。所谓杂交瘤技术，就是将具有无限繁殖能力并能分泌抗体的骨髓瘤细胞，与 具有分泌抗体能力但不能无限繁殖的B细胞，在一定条件下进行细胞融合，使之产生出双 功能细胞，即能无限度地繁殖又能无限度地分泌抗体的杂交瘤细胞。然后再经一系列选择培 养、克隆化、分离出单个细胞，使其通过分裂增殖而获得一个遗传特性十分均一的细胞。目 前，生物制剂公司所销售的MCAB都是鼠源性的，由于这种生产方式成本较高，因而导致 临床应用的抗体价格较高。八十年代产生的基因工程抗体技术是将抗体的基因按不同的需要 进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表达的抗体分子？。由于
11、这项 技术已被广泛地应用，目前销售于临床作诊断地抗体，价格已有了明显地下降。二、免疫组织化学技术的发展概况(一)免疫荧光细胞化学技术1941年，浣熊等建立了免疫荧光细胞化学技术，它的原理是根据抗原抗体反应的 规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测 组织或细胞内的相应物质。应用的方法有直接法、间接法、夹心法和补体法等。在荧光显微 镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位。目前，免疫 荧光细胞化学技术已经广泛地应用于许多研究领域，如免疫学、微生物学、病理学和临床检 验学等。由于免疫荧光细胞化学技术所具有的特异性、快速性和某方面的
12、准确性，又由于许 多新技术和仪器的应用如激光技术、电子计算机、扫描电镜和双光子显微镜、荧光激活细胞 分类器等，该项技术可发展至更高的阶段，开创更新的领域。虽然如此，应用于临床作为病 理学的诊断还是少之又少，相信随着各种技术的提高，在不久的将来，将会有更多的荧光抗 体被应用于临床的诊断。(1) 常用的抗体和蛋白质标记的荧光素有： 异硫氰酸荧光黄(Fluoresein isothiocyanate，FITC)：结晶粉末状，呈黄色、橙黄色或褐黄 色，易溶于水和酒精等溶剂，室温下可保存两年以上，最大发射光谱为520530nm，呈现 明亮的黄绿色荧光。 四甲基异硫氰酸罗达明(Tetramethylyod
13、amine isothiocyanate, TRITC):结晶粉末状，呈紫 红色，易溶于水和酒精等溶剂。最大发射光谱为620nm，呈现橙红色荧光。 四乙基罗达明(Tetramethylyodamine B200， RB200)：结晶粉末状，呈褐红色，易溶于酒 精和丙酮，但不溶于水。最大发射光谱为596600nm,呈现橙红色荧光。(2) 常用的荧光标记法 直接法：这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗 体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，于荧光 显微镜下观察检查，作出判断。评价：该法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检几
14、种免疫球蛋白的检测和病原体 的检测。但其存在不足就是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前 较少作为更多方面的检测。 间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体， 与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的 发光情况来确定所检测的抗原。评价：本法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强， 因而其敏感性强。目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第一 抗体的标记显示。1. 存在问题：2. 制作好的切片不能长期保存，影响各种资料的积累。3. 所作出的结论较主观。有些经固
15、定的石蜡切片不适合等。(二)免疫酶细胞化学技术这种技术的基本原理是通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，在检测时， 抗原抗体复合物中带有标记结合上去的酶，其特性可催化底物，在抗原抗体反应的部位上产 生不溶性的有色产物，从而可用一般光镜来检测判断，确定组织的来源、种属和部位。 评价：1. 优点：2. 可用光镜检查。3. 切片可长期保存，有利于资料积累。4. 可以会诊，所得结果较为客观。5. 既适用于冰冻切片，也适用于石蜡切片。 技术较为简单，易于普及和推广。1. 存在问题：2. 酶与抗体间的共价结合可损害部分抗体和酶的化学。3. 酶标记抗体分子量较大，对组织的穿透性较缓慢。4. 抗血清中的非
16、特异性抗体被酶标记后与切片中的抗原结合，常可引起背景的染色，影响 阳性物的判断。敏感性不强，目前已不被使用。（三）非标记抗体酶法由于酶标抗体存在许多问题，1974年Strernberger等人建立了非标记抗体酶法，其 中最具代表的方法是过氧化物酶法即PAP3法。奶头法的染色原理：应用第二抗体即桥抗体将抗原抗体结合后的复合物与PAP复合物连接 起来，形成较大的复合物，利用复合物中HRP （）水解底物而呈色。PAP由3个过氧化物酶分子和2个抗过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，较为稳定。 评价：PAP法自建立起至二十世纪九十年代初期被应用，它在当时来说具有较高的敏感性， 有人认为它比酶桥法灵敏度高出20倍左右，有人则认为它的灵敏度与放射免疫法相似。1. 存在问题
