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1、实验二植物总DNA的提取与测定一、实验目的学习和掌握DNA的微量提取法。二、实验原理小麦黄化苗经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如SDS），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖 杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用SDS法，其主要作用是破膜。SDS属阴 离子去污剂，要溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。SDS在溶液中带负电荷，能与带正电荷的蛋白质侧 链结合成复合物，当加入钾盐时，能与SDS 一蛋白质生成溶解度很小的沉淀一同去除。酚/氯仿/异戊醇的作 用是去除核酸制品中的蛋白质，并有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。异丙醇或乙醇的作用 是沉淀DNA。处理DNA样品
2、时，可在65C保温30min，较之37C处理有以下优点：RNA酶的最适作用温度为65C； DNA酶最适作用温度为37C，当用65C处理时，这些酶往往处于活性极低的状态而不会降解DNA: RNA中的某些总分会形成发卡结构，65C处理更有利于这些结构的松散，使RNA酶的作用更完全。三、药品1 .提取缓冲液100mmo/L NaCl100mmol/L Tris-Cl （pH8.0 ）50mmol/L EDTA1%疏基乙醇2. 20%SDS3. 5mol/L醋酸钾取29.5ml冰醋酸，用KOH颗粒调校至PH4.8，加水至100ml，室温保存，不可灭菌。4. 酚/氯仿/异戊醇（25： 24： 1）5.
3、异丙醇6. 70%乙醇四、实验流程称取0.1g小麦黄化苗叶片于预冷的研钵中，加入3倍体积（W/V，约300M l）提取缓冲液，在冰盘上研磨。 研碎后转入一 EP管中，再加约300p l提取缓冲液。加入20%SDS至终浓度为2%，约66p l。轻轻混匀后于65C水浴，10min。加入1/10体积的5mol/L醋酸钾（约66p l），于水浴中反应30min。离心（15krpm,10min,4 C）。取上相转入一新的EP管中，用等体积的酚/氯仿/异戊醇（25： 24： 1）抽提一次（上下晃动几次即可）。离心（12krpm,10min,20C）。取上相转入一新的EP管中，加入等体积的异丙醇，于室温下反应510min，其间将管至少颠倒5次。10. 离心（15krpm,10min,4C）。11. 弃上清液，用70%乙醇冲洗沉淀物，真空抽干或吹干，最后溶于1XTE中（约50p l）。五、注意事项研磨后应迅速加入提取液，因为提取液中含EDTA，能够螯合Mg2+等二价阳离子，防止破碎细胞中的DNA 酶降解DNA。提取过程中，转移上清液时所用的枪头最好用剪刀将尖头剪去，以避免对DNA造成的不必要的机械损伤。 干燥DNA时，要注意，过干或过湿都不利于DNA的溶解。冰盘（4个）、研钵（8套）、塑料烧杯（8个）、200M l微量加样器（2把）、离心机（1台）、水浴锅（65C）、 枪头及EP管
