裂解后的人全血FSC vs SSC的典型设置）流式细胞术数据分析目的就是需要确定所要研究的目的细胞器，这就涉及到 设门设门就是划定某一区域的细胞群体，对其单独加以分析或分选门的形状 可任意，方法有几种：（1）阈值设门FSC （前向散射光）是最常用的阈值参数 FSC和细胞的大小正相关用FSC设阈值，可以使低于该阈值的细胞碎片等 其他杂质的信号不被处理2）散射光设门以FSC和SSC （侧向散射光） 联合设门较常用其最大优点是可以排除碎片或噪声的干扰可以根据FSC vs SSC散点图上不同细胞分布不同来设门目的细胞群另外还有荧光设门、反向设门和组合设门流式细胞术的数据分析过程实际 上就是选门和设门的过程应该注意到设门是一个主观行为，是人为做出的决定, 不同的人设门会存在很大差异，它是流式细胞术中最难掌握的技术因此，对设 门有2点需要把握：首先，设门尽可能客观；其次，应该认识到设门需要主观 决策为了尽量减少主观判断带来的误差，最好分选一些细胞用显微镜观察来进 一步确认门的客观性和准确性流式细胞术的设门的注意事项：通过流式细胞术分析细胞样品时，欲获得更加准确的分析结果，应用最优化的设 门策略非常重要。
要考虑的因素包括：1） 排除细胞碎片2） 应用合适的荧光阴性对照3） 排除死细胞.4） 如果合适，使用一种共享标记物（比如CD45白细胞标记或与之等效的泛- 细胞群标记）染色5） 设置必需的荧光分析点图1）去除细胞碎片:在流式细胞仪上获取数据时，建立一个前向散射（FSC）VS •侧 向散射（SSC）点图，并通过调节各个光电倍增管装置以确定所有要分析的细胞 群都在点图的可视范围内在必要时，需要通过设置和调节FSC阈值，将大部 分的细胞碎片、气泡和激光背景噪的干扰排除在分析区域之外（都应该设在 FSC-low的区域）接下来，在FSC vs SSC点图中圈出感兴趣的细胞群的周围 区域（R1），这个区域可以被称为“R1-FSC vs SSC”2）应用合适的荧光阴性对照：染细胞时，建议您将细胞分在两个试管中，在其 中一个试管中，用荧光标记的抗体染感兴趣的细胞，而另一个试管应用荧光同型unlv抗体做为相应的阴性对照，这样有助于在分析中更精确地区分阳性信号和阴性的¥、」/.非冃.荧^光冃景3）排除死细胞：通过Propidium Iodide （PI）或7-AAD等检测细胞活性的标记染 细胞，以区分活细胞与死细胞。
首先建立FSC vs“细胞活性染色”点图，然后将 "Region 1-FSC vs SSC”设置在这个点图上之后，圈出活细胞群区域，称为 "Regio n 2-Viable”Unstained Controlm * N fpel E.Hp&c』dc4）如果合适，使用一种共享标记物染色有时候，可以染一种在感兴趣的细胞与 其他细胞都有表达的标记（例如在所有白细胞上都表达的CD45,）虽然这个步 骤不是必须的，但对于分析一些稀少细胞类型时有帮助首先，建立一个FSC vs "共享标记物”的点图，将"Region 2-Viable”设置于这个点图上然后，圈出所有 表达这个标记的细胞群，设为"Region 3 - Shared Marker”PE Isotype Control(R3)5）设置必需的荧光分析点图，现在可以根据需要建立荧光分析点图（例如，FSC vs FITC或FITC vs PE,等 等）确保将"Region 1 - FSC vs SSC”，"Region 2 一 Viable”，和"Region 3 - Shared Marker”（如果适合的话）等各个门都设置在每个荧光点图上应用相 应的荧光同型阴性对照有助于从背景荧光信号中区分出阳性信号。
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