ELISA 方法检测鸡蛋中的抗生素赵兰青，邓明镜，高阳（北京科技大学，化学与生物工程学院，生技 0901 班，100083）［摘要］ 建立了以间接竞争酶联免疫吸附分析法为基础，经过包被抗原，加 氯霉素标准品溶液和待测样品溶液后，再加抗体，然后加酶标记二抗和反应底物， 最后加终止液后测量490nm下吸光度值等操作步骤后，测定了氯霉素浓度的检 测下限为5ng/mL，定量范围为：5-50ng/mL氯霉素浓度的对数值Logivtg）与结合率B/Bo（%）的标准曲线方程为：y = -45.952X + 115.48, R2 = 0.9943,根据0-50 ng/mL相对应的曲线计算了未知样的浓度vtgS1=1.199ng/mL, vtgS2=386.1 ng/mL, 但是与实际浓度相差较大，且回收率异常最后对实验结果和干扰因素进行了分 析,以及对失败原因的探索,并进一步研究了实验条件的优化［关键词］间接竞争ELISA方法 氯霉素 分光光度法1 引言ELISA 属于标记免疫学技术的一种, 1971 年由瑞典的 EngVall 和荷兰 Van Weeman等人提出，1974年Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为吸附载体吸附抗 体（抗原），再与相应的酶标记物结合，使 ELISA 操作更方便、易重复，灵敏度 可高达ng至pg,因而成为生物化学，临床医学检验的常规测定方法之一；原则 上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶 性抗原。
因为其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和卫生检测 中得到了广泛的应用ELISA 常用的测定方法主要有直接法和间接法两种：直接法是酶标记抗体与 待检测样本中固相抗原直接作用，加入底物后，显色；间接法是使已知抗原吸附 在固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，再加入酶标记抗同种动物抗体的免 疫球蛋白（二抗），使与特异抗原抗体复合物的抗体作用，加入酶底物，显色 ELISA 有许多改良方法，如夹心法、双抗夹心法、竞争法、酶—抗酶法和均质法 等常用方法大致可分为三类：（a）测定抗体的间接法；（b）测定抗原的双抗夹 心法；（c）测定抗原的竞争法前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适 用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析本实验旨在建立一种简单、快速、回收率高的氯霉素含量测定方法，改良 优化其方法步骤，以节约实验室检测的费用及检测的时间，并进一步应用于 食品安全检测2 实验部分2.1 试剂与器材2.1.1 试剂抗体：鼠抗氯霉素（CAP）单克隆抗体抗原： CAP-BSA酶标记抗体（二抗）：HRP-羊抗鼠样品：鸡蛋 缓冲液：1） 包被液：0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液（Na2CO3 0.159 克，NaHCO3 0.294 克，蒸馏水稀释至 100mL）。
2） 洗涤及稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBST 溶液NaCI 8 克，KH2PO4 0.2 克， Na2HPO42.9 克，Tween—20,0.5mL.蒸馏水加至 1000mL）3） 底物溶液：先配制pH5.0柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液取0.1mol/L柠檬酸溶液 24.3mL，加 0.2mol/L（27.4g/L）NaHPO4 溶液 25.7mL，再加蒸馏水 50mL，然后 将 80mg 邻苯二胺溶解其中，再加 30%H2O2 0.20mL 即可应用，用时新鲜配制、 避光4） 终止液： 2mol/LH2SO42.1.2 器材聚苯乙烯微量反应板（96孔），可调式微量吸液器（200uL），八道可调式移 液器，培养皿，小烧杯，隔水式恒温箱，酶联免疫检测仪2.2 实验步骤2.2.1 包被抗原用包被液将抗原稀释为2ug/mL，每孔加150uL，4°C冰箱放置16~18小时2.2.2 洗涤倒尽板孔中液体，加 200uL 洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板 倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽2.2.3 封闭用稀释液将BSA稀释成浓度为200ug/mL溶液，每孔加150uL，37C放置1 小时。
2.2.4 洗涤倒尽板孔中液体，加 200uL 洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板 倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽2.2.5 加标准品用稀释液将氯霉素标准品稀释成0.2 ng/mL至100 ng/mL溶液，每孔50微升 同时作稀释液对照因为4.7中加入50uL抗体，所以氯霉素被稀释为原浓度的 1/2，即 0.1ng/mL 至 50ng/mL）2.2.6 加被测液 如下图所示，加入被测样，每孔50微升表 1 酶标板上各孔的加样设计123456789101112ABLKBLKBLKBLKBLKBBLK00SIBLKCBLK0.10.1SIBLKDBLK0.50.5S1BLKEBLK11S2BLKFBLK55S2BLKGBLK1010S2BLKHBLK5050BLKBLK（注：数字表示加氯霉素的浓度 ng/mL ，S1 和 S2 分别表示待测样 1 和待测样 2，BLK 表示空白对照）2.2.7 加抗体向各孔中加入50uL抗体（用洗涤液稀释为200ng/mL） ,37°C放置1小时2.2.8 洗涤倒尽板孔中液体，加 200uL 洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板 倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
2.2.9 加二抗将二抗用稀释液按1:5000稀释，每孔100微升，放置37C 1小时2.2.10 洗涤倒尽板孔中液体，加 200uL 洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板 倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽2.2.11 加底物 邻苯二胺溶液加100微升，室温暗处10—15分钟2.2.12 加终止液每孔加 50 微升 H2SO4（2M）2.2.13 观察结果 用酶联免疫检测仪记录 490nm 读数3 结果与讨论3.1 标准曲线的绘制3.1.1酶联免疫检测仪记录490nm下吸光度表2酶联免疫检测490nm吸光度123456789101112A0.1250.0770.0790.0920.096B0.0840.8860.8770.8960.067C0.0880.8490.8770.8440.069D0.0880.8660.8710.8720.067E0.0980.8710.8340.1540.071F0.0920.7030.7670.150.075G0.0990.6440.6570.1660.089H0.1460.3710.3660.120.1113.1.2结合率B/B°(%)的计算随机取5个空白的平均值(B5—F5),计算得平均值BLK= (0.067+0.069+0.067+0.071+0.075) /5=0.0698;氯霉素浓度为0时，其浓度的吸光度值OD0= (0.886+0.877) /2=0.8815;同理，其浓度为 0.1-50ng/mL 时，吸光度的平均值分别为：OD0.1=0.863OD0.5=0.8685OD1=0.8525OD5=0.735OD10=0.6505OD50=0.3685根据结合率B/B0(%)= (OD-Blank) / (OD0-Blank)X100,分别计算出结合率 为：B/B0(%)—0.1=97.72B/B0(%)—0.5=98.40B/B0(%)—1=96.43B/B0(%)—5=81.95B/B0(%)—10=71.54B/B0(%)—50=36.803.1.3 标准曲线的制作与优化 因为在溶液中，抗原与抗体结合率更倾向于与浓度的对数值呈线性关系，故 绘制标准曲线时，应以浓度的对数值为横坐标。
由以上数据得浓度的对数值Log】vtg)与结合率B/B0(%)的关系如下表：浓度(Vtg) (ng/mL)0.10.5151050Log10 (vtg)-1-0.3010300.6989711.69897B/B0(%)97.7298.4096.4381.9571.5436.80我国关于样品检测下限的定义为：即相对于空白可检测的最小样品含量，也 就是样品最低检测浓度定义样品检测下限为三倍空白标准偏差，即3a空 本实验中，可以依据标准曲线的线性程度判断检测下限绘制标准曲线时，若横 坐标从Log】0.1)开始，将其绘成曲线图，添加趋势线和显示公式，如下：其B/Bo（%）几乎全部接近于100,且数值随Log】vtg）的变化不成线性，若横坐 标从Log10（0.5）或Log10（1）开始，其线性程度也不理想，说明0.1,0.5,1未达 到检测下限R2 = 0.9243 R2 = 0.947经过对个别点的取舍，曲线的线性程度提高，标准曲线(曲线4)方程：y = -45.952X + 115.48，R2 = 0.9943但是定量计算的范围变窄(5-50ng/mL)，即只 能检测在此范围内浓度的氯霉素样品。
若结合率＞81.95或＜36.80，该标准曲线的 参考价值不大3.2 待测样品中氯霉素含量的计算根据表2 ，待测样品1吸光度的平均值ODS1=(0.896+0.844+0.872)/3=0.871; ODS2=(0.154+0.15+0.166)/3=0.157所以相对应的结合率为：B/B0(%)—S1=( ODsi-Blank) / (OD0-Blank)X100 =(0.871-0.0698)/( 0.8815-0.0698) X 100=98.71 ;B/B0(%)—S2=( ODs2-Blank) / (OD0-Blank)X100= =(0.157-0.0698)/( 0.8815-0.0698) X 100=10.74 但是两个样品的结合率均在精确定量范围之外，为保证浓度最终结果的可靠 性和科学性，根据曲线3的方程，计算得：Log10(vtgS1)=0.07896 vtgS1=1.199ng/mLLog10(vtgS2)=2.587 vtgS2=386.1ng/mL事实上,S1浓度vtgs1=0 ng/mL,不在定量范围之内；S2浓度vtgs2=22 ng/mL, 在定量范围内。
显然偏差太大，这可能是由于稀释过程中没有规范操作等原因引 起的所以计算而出的浓度值参考价值不大3.3 回收率的计算已知加入氯霉素浓度d=22ng/mL (S1浓度vtgs1=0 ng/mL , S2浓度vt。