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1、利用实时定量和一法分析基因相对表达量,-()-* , California 94404;勺 ,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：现在最常用的两种分析实时定量实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对 定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样 品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异方法是实时定量 实验中分 析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了 该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种-衍生方法 的推导和应用，它们在实时定量
2、数据分析中可能会被用到。关键词：反转录定量相对定量 实时反转录 （）是基因表达定量非常有用的一种方法（ ）。实时技术和 的结 合产生了反转录定量 技术（ ）。实时定量 的数据分析方法有两种：绝对 定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本 的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表 达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 进行绝对 定量已有多篇报道（ ），包括已发表的两篇研究论文（ ）。在有些情况下， 并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我 们
3、说 基因在经过某种处理後表达量增加 倍比说该基因的表达从 拷贝细胞 增加到拷贝 细胞更加直观。用实时对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的 验证。-方法可用于定量 实验来计算基因表达的相对变化：-公式的推导， 以及实验设计，有效性评估在（）中有介绍。用- 方法分析基因表达数据在文献中也有报道（）。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文 还介绍了- 两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量数据分析中都可能被 用到。-方法. 方法的推导指数扩增的公式是K m -b ExyHI这里，是第 个循环後目标分子数，是初始目标分子数，是目标分子扩增效率 是循环数， 代表目标
4、扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。因此：丫丁 =怎 X -J 十 xi- X = Ax口是目标分子扩增达到阈值时的循环是目标分子达到设定的阈值时的分子数。数。 是一个常数。对于内参反应而言，也有同样的公式：碍=& X (1 +旳g =心用 除以 得到：如X (1 +型m _愍 昭_尽I X 1 + E沪-R _尽对于使用 探针的实时扩增而言， 和 的值由一系列因素决定：包括探针所带 的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及 荧光阈值的设定。因此常数 并不一定等于 。假设目标序列与内参序列扩增效率相同：上工=上忙=匕或:烁 x 1 + E严T = K.代表经过均一
5、化处理过的初始目标分子量；表示目标基因和内标基因值的差 异( )整理上式得：烁=KX (1 + 砂一77最后用任一样本 的 除以参照因子（, ）的得到：拓g KX (1 + E)Ab8在这里丁 = 一山-| 乂1 对于一个少于 的扩增片断而言，如果 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增 效率接近于 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是.：!.! i |i -i i :!=i !. 方法的假设和应用要使计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两个反应 是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释後扩增产物如何 变化。FIG, 1, VfiltditlE
6、oti of ih 申 2-A4CT mt hr id Ai npl i fir t ii n i “I 1 DNA svnihesizcd from different amounts of RNA. Tht efficiency of cation of the tcirpl Rene 比-“卩御 and irtterrml runtro! (GAPDH was x/leii l ned l ls 3 tif； t i| | rll rll、l、I A = .1图 显示的是 样品在 倍稀释范围内的实验结果。对于每一个稀释样本，都用 和特异的荧光探针及引物进行扩增。计算出和 的平均值以及值，
7、通过浓 度梯度的值对值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于，说明目标基因和内标 基因的扩增效率相同，就可以通过方法进行相对定量。在图中，直线斜率是, 因而假设成立，方法可以用来分析数据。如果两个扩增反应效率不同，则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引 物，优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。. 内标和参照因子的选择使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应中的 进行均一化处理。标准的 看家基因一般都可被用作内标基因。适合于实时 反应内标基因包括,0 , 以 及 。当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。我们推荐在应用某一基因作 为内标之前首先
8、确证该基因的表达不会受实验处理的影响。验证实验处理是否对 内标基因表达产生影响的方法在 部分有描述。方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是 把未经处理的样品作为参照因子（ ）。经内标基因均一化处理後，通过方法计 算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表 示。对于未经处理的参照样，而。所以根据定义，未处理样本的倍数变化 为。而对于那些经过处理的样本，相对于参考因子基因表达的倍数为-.同样 的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选 时刻的样本 作为参照因子。有些情况下，并不是比较不同处理样本基因表达差异。例如，有的是想看某一
9、器 官中特定 的表达。在这种情况下，参照因子可能是另一器官中该 的表达。表 显示了大脑和肾脏总 中 和 转录本的 值。在这一个例子中，大脑被人为的选择 为参照因子，通过计算得到肾脏 表达量经 校正後相对于大脑的表达量的结果。尽管相对定量方法可用于这种组织之间的比较，但结果的生物学解释是相当复杂 的。不同种类细胞中目标和参照转录本单一的相对量变化可能在任何特定的组织 中都存在。TABLE 1Tieiimn M Ruplbm慣 De刼 WW门 Tjujrei: find RrfeieiKe Aw Amplified life 弓帰脚避理 Welfc-ACk IA邛.t-mc Q -Av* 岳函耐|
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