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1、生物工程的灭菌技术麦浩荣(广东省石油化工设计院 广州 510130) 摘要：本文重点介绍了发酵工程中培养基及有关设备、物料和空气管道的灭菌技术，确保达到无菌要求，满足纯种发酵。并且对阀门的选用做了简单的介绍。 关键词：发酵、灭菌、无菌一 前言 生物工程是当代科技的高新技术，是21世纪最具发展潜力的产业。生物工程最大的特点在于充分利用生物物质资源，节约能源，易于实现洁净生产，而且可以实现一般化工技术难于实现的化工过程。本人参与一项生物工程的设计工作，该工程是根据科研成果直接设计转化为工业化大规模生产装置。所生产的产品为透明质酸聚合物(PHA),为生物可降解塑料产品的添加剂。设计主要是根据中试结果
2、进行放大设计。该生物工程包括配料、发酵、絮凝、压滤、造粒、提取、产品干燥回收、溶剂回收等工序。其中配料与发酵属于生物工程，而絮凝及后面的工序属于化学工程。这里主要介绍发酵工程的灭菌技术。常用的发酵工艺流程图见图1所示。图1 典型的微生物分批培养工艺流程图二灭菌技术 生物化学工程是运用化学工程的原理和方法对实验室所取得的生物技术成果加以开发，使之成为生物反应过程的一门科学，是以活的细胞为催化剂或由细胞提出来的酶为催化剂的反应过程。所以必须进行纯种培养，也就是只允许生产菌存在和生长繁殖，不允许其他微生物共存。因为生物反应系统中通常会含有丰富的营养物质，易受杂菌污染，会产生以下不良的后果： 如果受到
3、杂菌污染，会使生物反应基质或产物因杂菌消耗而损失，造成生产能力下降； 由于杂菌产生的一些代谢产物，或者杂菌改变了发酵液的某些理化性质，使产物的提取变得困难，造成收得率降低或使产品质量下降； 污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH值，从而使生物反应发生异常变化； 发生的噬菌体污染，使生产菌细胞裂解，而使生产失败等等。所以整个发酵过程必须强调无菌操作，牢固确立无菌观念。除了设备应严格按规定要求，保证没有死角，没有构成感染可能的因素外，必须对培养基和生产环境进行严格的灭菌和消毒，防止杂菌和噬菌体污染，达到无菌要求。必须注意几方面：菌体无杂菌，培养基及有关设备管路彻底灭菌，设备严密，空气灭菌。 2.
4、1培养基灭菌 培养基灭菌是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中除去之。工业规模上的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用，其中热灭菌最为简便、有效和经济。 对于液体培养基的热灭菌，工程上所要解决的课题是：将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数的N，需要多高的温度，多长的时间为合理，这决定与杂菌孢子的热死灭动力学，反应器的形式和操作方法，还决定于培养基中有效成分受热破坏的可接收范围。2.1.1 分批灭菌微生物受热被杀死，主要原因是高热能使蛋白质变性。这种反应属于单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比。即： -dv/dt=kN (2.1) 式中N
5、为任一时刻的活细菌浓度，个/L；t为时间，min；k为比热死速率常数，min-1。对式(2.1)积分，取边界条件t0=0,N=N0，得：lnN/ N0=-kt 或 N= N0e-kt (2.2)维持灭菌温度T不变，经历不同的灭菌时间，检测相应的N 按lnN/ N0对t作图，如图2 所示。直线的斜率为k，k除了决定与菌体的抗热性能之外，还明显地受灭菌温度T的影响。图2 大肠杆菌的失活细菌孢子的热灭动力学与营养体细胞的有所不同。如图3所示。 图3 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热死速率从图3可以推测，细菌孢子壁具有较大的热阻。但霉菌孢子的热阻比细菌的小的多(见表1)，这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。当
6、温度超过120时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热死灭动力学也接近与一级反应规律。表1 典型发酵环境中各种微生物对温热灭菌的相对热阻生物体种类相对热阻营养细胞和酵母1.0细菌孢子3x106霉菌孢子210病毒与噬菌体15由表1 可以得知，对培养基进行灭菌必须以细菌孢子为杀灭对象。营养细胞易于受热死亡，表明其热死速率常数k值很高，在120灭菌，其k值可大至1010(min-1)数量级，而细菌孢子的k值在120时只有100数量级。k除了决定菌体的种类及存在形式外，还是温度T的函数。由于微生物的热死灭接近于化学反应的一级动力学，因此，比热死灭速率常数k与灭菌温度常数T的关系可用阿累尼乌斯方程来表示。
7、即k=Ae-E/RT （2.3）或 lnk=lnA-E/RT （2.4）式中A为频率因子，s-1, E是死亡活化能，J/mol；R为通用气体常数，J/molK。对式（2.4）两边求导，得dlnk/dT=E/RT2 （2.5）由式（2.5）可知，反应的E愈高，lnk对T的变化率愈大，亦即T的变化对k的影响愈大。培养基灭菌既要杀死杂菌的孢子，又要保存其中的有效成分。试验证明，细菌孢子热死灭反应的E很高，而有些有效成分热破坏反应的E较低，因而提高灭菌温度T会加快细菌孢子的死亡速率，从而缩短高温下的灭菌时间，由于其他有效成分的热破坏E很低，温度提高只能稍为增大其热破坏程度，但灭菌时间的显著缩短，其结果
8、是有效成分的破坏量反而大为减少。2.1.2 分批灭菌设计工程上要求绝对无菌是不可能的，但只要是培养基中的杂菌减低到合理的程度就可以了。对于周期长，成本高的发酵，常取灭菌后一罐培养基中残存的活菌孢子数N=10-3个，即灭菌103次，存活一个活菌孢子的机会为1次。N/N0是灭菌程度指标，不同的发酵体系有不同的N/N0。在分批灭菌中，为计算方便，取ln N0/N为设计依据，如培养基1000m3，含菌106个/ml，要求灭菌后，活菌数N=10-3个。则N/N0=10-3/(1000x106x106)=10-18lnN/N0=41.45分批灭菌也称实罐灭菌，全过程包括升温、保温、降温三个阶段。三个阶段分
9、别对孢子的死灭和培养基中有效成分的破坏做出大小不同的贡献。其典型的T-t图如图4。灭菌主要在保温过程实现，但升温的后期和冷却的初期培养基的温度高，因而亦有一定的灭菌效果。图4 分批灭菌时典型的温度变化孢子受热死亡规律符合-dv/dt=kN，故 lnN0/N=kt； lnN0/N=lnN0/N1+ lnN1/N2+ lnN2/NlnN0/N是由三块面积lnN0/N1，lnN1/N2，lnN2/N合成的。可以合理设计这三块面积的大小，使其和等于lnN0/N的预定值。然而分批灭菌的T-t过程不是任意给定的。它取决于加热方式，换热面积的大小，传热系数的高低，换热介质的温度培养基的质量等诸多因素。要尽可
10、能加快换热速度，以尽可能缩短升温和冷却的时间，延长保温时间，以达到细菌孢子的杀灭和培养基中有效成分的最大保留。在本设计中，一、二级种子罐灭菌是采用实罐灭菌的方式来进行的。2.1.3 连续灭菌连续灭菌的加热、保温和冷却三个阶段是分别在不同的专有设备中进行。由于培养基能在短时间内加热到保温温度，并能很快被冷却。因此，可在比分批灭菌更高的温度下灭菌，灭菌时间缩短，这有利于减少营养物质的破坏。连续灭菌所用蒸汽压力一般高于5x105Pa(表压)。图5、图6两种基本的灭菌装置。图5是由管式或板式换热器把培养基间接加热和冷却；图6则用蒸汽把培养基加热到灭菌温度，经保温后，再进行闪急冷却。图5 板式热交换器连
11、续灭菌装置图6 蒸汽喷射连续灭菌装置第一种方式的特点是单位体积的热交换器具有较高的传热面积，且可根据生产需要，改变其换热面积的大小。第二种方式是用蒸汽直接喷射物料，被加热的物料通过保温，最后用闪急膨胀法冷却。其特点是加热、冷却极为短暂，缺点是培养基被蒸汽的冷凝水稀释。在本设计里，培养基的灭菌采用了以上两种方式的组合形式，并加以改进，流程见图7。图7 配料液连续灭菌流程图1，4板式换热器；2连消塔；3维持罐在该流程中，蒸汽直接通进连消塔，使配料液的温度迅速提高，并在维持罐内保温，既缩短了灭菌时间，也省去了闪急冷却装置。2.2 空气除菌在发酵过程中，微生物的生长和繁殖需要大量的氧气，这就需要输入大
12、量的空气来提供氧气。在空气中的微生物多为细菌、细菌孢子，也有真菌、酵母和病毒。其大小从几个微米到几百微米不等(表2)，小的微生物附在空气中的灰尘上，灰尘的平均尺寸约为0.1m。粗滤器可将粗的微粒除去，0.52.0m的微粒及细菌微生物由空气过滤器除去。表2空气中细菌及细菌孢子的代表种类菌种宽，m长，m产气气杆菌1.01.51.02.5蜡状芽孢杆菌1.32.08.125.8地衣芽孢杆菌0.50.71.83.3巨大芽孢杆菌0.92.12.010.0枯草芽孢杆菌0.51.11.64.8金黄小球菌0.51.01.03.0普通变性杆菌0.61.20.91.7空气中微生物的数量与温度及其他环境条件有关。城市
13、空气中的微生物密度比农村和山区高。空气中微生物数量级为103104微粒/m3,每提高2.5m，空气中的微粒数可减少一个数量级。2.2.1 空气除菌方法加热灭菌 虽然细菌孢子耐热性很强，但在较高的温度时也能使之破坏。可以利用空气被压缩时所产生的热来灭菌，为了保证压缩后的空气具有较高的温度，在压缩空气出口管包裹保温层。在单级绝热压缩机(3kg/cm2)运转时，吸进的空气为20或27时，则压缩后出口空气的温度分别上升到150或270。这种灭菌方法必须保持有足够的灭菌时间，为了彻底除菌，必须在罐前安装一个空气过滤器。辐射灭菌 波长226.5328.7mm的紫外线对空气中微生物的杀菌效力最强。但设备投资
14、高，在发酵工业中还很少应用。化学灭菌 使空气在杀菌剂溶液中通过或喷洒于空气中的微生物，但必须除去带杀菌剂的水气和雾后才能应用，工业生产中也很少应用。静电除尘 静电除尘的特点是能量消耗少，空气的的压头损失小，约为4002000Pa；对1m的尘粒捕集效率可达99%以上。缺点是设备庞大。介质过滤 发酵工业制备无菌空气广泛采用纤维过滤器。在本工程设计中，就是采用玻璃纤维过滤器加金属过滤器来制备无菌空气。2.2.2 空气除菌流程比较理想的空气除菌流程应具备以下特点。高空采风，吸气风管设置在工厂上风向高2030m处，减少吸入空气的细菌含量。在空压机空气入口处安装中效或高效前置过滤器，以减轻总过滤器的负荷。
15、采用无油润滑压缩机，减少压缩后空气中的油雾污染，压缩机后采用冷却型的空气储罐，可降低空气的温度，同时除去部分润滑油。采用二级冷却二级旋风分离器，使油水分离较完全。采用旋风金属网除雾器，除去空气中的雾滴。用蒸汽加热器将空气加热至约50，使空气的相对湿度低于60%，再进入总过滤器以保证总过滤器维持干燥状态。空气经总过滤器后进入分过滤器，再进入发酵罐，空气的除菌程度达到99.999%。图8是一个典型的除菌流程，在本设计中基本上采用该流程。图8 两级冷却、加热除菌流程图1粗过滤器；2压缩机；3贮罐；4，6冷却器；5旋风分离器；7丝网分离器，8加热器；9总过滤器三阀门的选用发酵罐物料输送阀门的要求甚严，既要保证运行时绝对不漏，否则将造成整批物料的染菌，同时要承受定期蒸汽灭菌高温的影
