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1、第六节大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、基本知识核酸不能自己进入细菌，而是需要帮助，并对细菌经过处理，才能穿过细胞的内、 外膜进入，在里边表达和复制。?感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂 时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Competent cells。?转化（Transformation :是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传 性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技 术。2二、大肠杆菌感受态细胞的制备常用CaCl 2成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克超螺旋质粒 DNA产生 5 M062X0
2、7个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒上进行的常规克隆的 需要。适用于大多数大肠杆菌菌株，并且快速，重复性更好。制备的感受态细胞可贮 存于-70C,数月至1年。但保存时间过长会使转化效率受到影响。新鲜细胞 4 c保 存可用5天。用于电转化法的感受态细胞的制备使用低盐缓冲液或水洗细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA分子导入受体细胞。（具体 操作及参数，参考仪器说明3?下列有3个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的：-转化缓冲液中试剂的纯度 为田胞的生长状态破璃和塑料器皿的清洁度4例：Cacl 2法制备感受态细胞（化学法步骤：1从于37c培养1620小时的新鲜平板中挑取一个单菌落
3、（直径23mm，转到 一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37c剧烈振摇培养约3小时。 为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞/ml,可每隔2030分钟测量OD 600值 来监测培养物的生长情况。2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml内烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0C。3于4 C,离心10分钟,以回收细胞。4倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。55以10ml用冰预冷的0.1mol /L Cacl 2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。6于4C,离心10分钟.以回收细胞。7倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的这量培
4、养液流尽。8每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol /L CaCl 2重悬每份细胞沉淀。9分装成200ul ,贮存于-70C、4 c备用。？转化6三、转化方法：?电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将 载体DNA分子导入受体细胞。?化学方法（热激法:使用化学试剂（如CaCl 2制备的感受态细胞，通过热击处理 将载体DNA分子导入受体细胞。7?电转化法：当大肠杆菌暴露在电场中时，细胞膜会不稳定而诱导形成暂时孔洞，于是DNA 分子进入细胞。电穿孔法最初用于将 DNA导入真核细胞，通过优化各个参数，每微 克DNA可以得到1091010转化体。影响参数：电场强
5、度；电脉冲的长度；DNA浓度;质粒的大小。一般电转化的效率是用化学 方法制备的感受态细胞的转化率的1020倍。而且，制备用于电穿孔的细胞要比制 备感受态细胞更容易得多，低盐溶液或水洗，加10%的甘油,-70C保存。8?化学方法：1用贮存于-70C、4 C或新鲜的感受态细胞悬液中各取200ul转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA （体积10ul ,DNA 50ng，轻 轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。2将管放到预加温到42c的循环水浴中，恰恰放置90秒，不要摇动试管。3快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却12分钟。4每管加800ul SOC培养基。用水浴将培养基加温至37 C，然后将管转移
6、到37c摇床上，温育45分钟使细菌复苏， 并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率 ，在复苏期中， 应温和地摇动细胞。95将适当体积（每个90mm平板可达200ul已转化的感受态细胞转移到含 20mmol /L MgS04和相应抗生素的SOB琼脂培养基上。用一无菌的弯头玻棒轻轻 地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。6将平板置于室温直至液体被吸收。7倒置平皿，于37c培养,1216小时后可出现菌落。10第七节含重组质粒的细菌菌落的鉴定几种方法来鉴定含重组质粒的细菌菌落：1小规模提取质粒DNA进行限制酶切 分析;2西:补;3插入失活;4杂交筛选5菌落PCR。11一、小规模制备质粒D
7、NA进行限制酶切分析要挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，分离质粒DNA后用限制酶进行消 化,再通过凝胶电泳进行分析。该方案颇费气力，但这是首选的方法。在实际应用中， 有可能在23小时内提取和分析36份小量制备的质粒DNA。12二、a互补许多载体都带有Lac Z基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码a- 互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 &半乳糖甘酶实现基因内互补（俄互补。当这 种载体转入可编码 代半乳糖甘酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异内基-&D硫代 半乳糖甘（IPTG的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性， 但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。实
8、现 优互补现象。由互补产生的代半乳糖甘酶（Lac Z能够作用于生色底物（X -gal而产生蓝色的 菌落，当在载体的该基因编码序列之间的多克隆位点，插入一个外源DNA片段时，会 造成Lac Z （基因的失活，破坏e互补作用，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质 粒的菌落为蓝色。130互补现象的检查：1在一事先制备好的含相应抗生素的LB琼脂平板上加40ul X gal贮存液（以20mg /ml的浓度溶于二甲基甲酰胺中和 4ul （IPTG溶液（浓度为200mg /ml。溶液涂布在事先制备的琼脂平板表面。X -gal贮存液的配法：将X -gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg /ml浓度的溶液，装于
9、玻璃或聚丙烯管中，装溶液的管应以锡柏包裹以防可见光使X -gal受到破坏，应贮存于-20C保存。该溶液不必过滤除菌IPTG溶液的配法：将2g IPTG溶于8ml水中，用水调节体积到10mL 0用0.22um一次性滤器过滤除菌，分装成1ml小份,贮存于-20C142将待检细菌接种到平板上，用接菌环或牙签划线接种，也可将100ul细菌悬液涂 布在琼脂培养基表面。倒置平板于 37c培养1216小时。3于4c将平板放置数小时，使蓝色充分显现。带有 &半乳糖甘酶活性蛋白的菌 落中间为谈蓝色，外周为深蓝色。白色菌落偶尔也在中央出现一个淡蓝色斑点，但其 外周无色。a互补蓝白斑选择15三、插入失活这种方法只能
10、用于比较老的载体（如pBR322,这些载体带有两个或更多个抗生素抗性基因和分布适宜的限制酶切位 点。待插入的DNA及已纯化的质粒DNA都用限制酶消化，这些酶的识别位点只位 于一个抗生素抗性基因区内。在适宜浓度下将两个DNA连接后，用连接产物转化大肠杆菌，选择对第二种抗生素有抗性的转化体。1617在氨苇青霉素存在下生长的菌落，一些含有重组质粒，而另一些可能含有无外 源DNA而在连接过程中自身环化的质粒 DNA。为区别两种转化体，用两种分别含 有氨苇青霉素和四环素的平板，在互相对应的位置上，各自接入同一菌落。在四环素 平板中存活并生长的菌落没有外源 DNA插入。在四环素平皿中不生长而在氨苇青霉素平
11、板中生长的菌落含有带失活的terr基因的质粒，这些质粒可能带有外源DNA 序列。18通过灭活质粒所携带的抗生素抗性基因来筛选外源DNA的插入19?Figure 4.18. Recombinant selection withpBR322. See text for details. The inset shows how replica plating is performed.20四、杂交筛选一种在硝酸纤维素滤膜上原位裂解细菌菌落并使释放出的DNA非共价结合于滤膜的方法，结合于滤膜上的DNA可与相应的放射性标记核酸探针进行杂交。是鉴定含目的DNA的重组质粒最常用的技术。很容易同时筛选数十万个
12、细菌 菌落,从中找出带有含靶序列的重组质粒的菌落，最后，小量制备质粒DNA进行限制 酶切分析和Southern杂交以证实这些质粒的结构。21固体支持体及其特点：1尼龙膜:最耐用，可以承受几轮杂交及高温洗膜操作，可用于不同的探针依次筛 选的情况。2Whatman 541滤纸:有很高的湿强度，主要用于筛选一些基因文库。（保存在微，用于杂交量滴定板各个孔内的单菌落复印菌落转移到滤纸上。裂解、固定3硝酸纤维素滤膜：与Whatman 541滤纸相比杂交信号较强，更适合常规的细菌 筛选。22?现有许多方法可用于放射性探针在溶液中与固定在滤膜上的核酸的杂交，这些方法在以下方面有所不同：1所用的溶剂和温度（如
13、于68c在水溶液中或于42c在50%甲酰胺中。2溶剂的体积和杂交的时间（体积大时可长达3天,或体积最小时，短至4小时。3振摇的程度和方法（持续摇动或固定。4阻断探针对固相基质表面的非特异性吸附的试剂，如Denhardt试剂或BLOTID。5标记探针的浓度及其比活度。6可增进核酸重缔合率的化合物，如葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇的使用情况。7杂交后洗膜的严格程度。23（一将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上适用于对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落 （100200进行筛选。将这些菌 落归并到一个琼脂主平板，和第二个琼脂平板表面的一张滤膜上。培养一段时间后 对菌落进行原位裂解。主平板贮存于 4 C直至得到筛选结
14、果。1在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张滤膜。2用无菌牙签将各个菌落先 转移至滤膜上，再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。按一定的格子进行划线接种（或打点,划出长23mm的短线。每一菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。在滤 膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322的菌落。（阴性对照以区分放 射性标记探针与重组质粒的特异性退火和非特异性的杂交背景。243倒置平板，于37c培养.直至划线的细菌生长达到0.51.0mm的宽度。4用针头穿透滤膜直达其下的琼脂，在硝酸纤维素滤膜3个以上的不对称位置作 标记。在主平板相同的位置上也作上标记。5用Para巾lm膜封好主平板，倒置
15、贮放于4C ,直至获得杂交反应的结果。6裂解细菌，使DNA结合于硝酸纤维素滤膜。25（二将菌落影印在硝酸纤维素滤膜上？方法一：适用于必须通过杂交来筛选大量菌落时，如用质粒载体构建的cDNA文库转化细菌并铺平板。这时直接用转化混合物 将细菌铺于一张无去污剂的硝酸纤维素滤膜上，然后通过滤膜与滤膜之间的接触制 备影印滤股。26?方法二：适用于同时从琼脂平板表面把许多细菌菌落转到硝酸纤维滤素膜上。可用于任 意大小的菌落，但小菌落（0.10.2mm效果最佳，与较大的菌落相比，小菌落的杂交信息 更清晰，而弥散程度更低。可用此技术在每张 138mm滤膜上筛选多达2X04个菌落 或在每张82mm滤膜土筛选104个菌落。27操作：1、方法11用一支软铅笔或圆珠笔给干的无去污剂的硝酸纤维素滤膜编号,然后用水浸湿，将其夹在于的Whatman 3mm滤纸中间，用锡箔包裹整 叠夹好的滤膜，高压蒸气灭菌151bf/in2（1.034x105Pa准备足够的滤膜以使用每个 平板制备1张主滤膜和2张影印滤膜。2用无菌平头银子把一张无菌滤膜放到前一 大制备的含相应抗生素的LB（或SOB琼脂平板上，编号的一面朝下，当滤膜彻底湿润 后,将滤膜从琼脂平板上剥离，编号的
