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1、医学论文-不同刺激剂和培养环境对CD4+ 、 CD8+ T细胞内细胞因子表达的影响【关键词】 流式细胞术;,T细胞亚群;,细胞因子;,刺激剂;,培养条件Cytokine expression of CD4+ and CD8+ T cells induced by different stimuli under different culture conditionsAbstract AIM: To investigate the effect of different stimuli and different culture conditions on the cytokine expres
2、sion of CD4+ and CD8+ T cells. METHODS: PBMCs were isolated from normal human peripheral blood and cultured with three kinds of stimuli (PHA, antiCD3 and antiCD28 mAbs, PMA and ionomycin) under four different culture conditions (room temperature, 37 water bath, 37 incubator, 37 and 50 mL/L CO2 incub
3、ator) for 4.55 h and intracellular cytokines (IL2, IFN and TNF) in T cells were assessed by flow cytometry (FCM). RESULTS: Cytokine expression of CD4+ and CD8+ T cells varied when treated with different stimuli under different conditions. PMA had the strongest stimulative effect on cytokine expressi
4、on of PBMC, while the effect of antiCD3 mAb was weaker, and that of PHA was the weakest. Different culture conditions did not greatly change the cytokine expression profile of T cells (P0.05) except that there were very few cytokine producing cells when PBMCs were cultured at room temperature. CONCL
5、USION: AntiCD3 and antiCD28 mAbs, PMA and ionomycin are recommended for the stimulation of PBMCs and detection of intracellular cytokine using FCM. Culture temperature but not the concentration of CO2 is the most important factor during the short term T cell stimulation. Keywordsflow cytometry; T ce
6、ll subset; cytokine; stimulus; culture condition摘 要 目的: 探讨不同的刺激剂和不同的培养条件对CD4+和CD8+ T细胞内细胞因子表达的影响。方法: 分离正常人的外周血单个核细胞（PBMC）, 分别加入3种不同的刺激剂（PHA, 抗CD3和抗CD28 mAb, PMA和离子霉素）, 置于4种不同的培养环境下（室温, 37水浴, 37培养箱, 37 50 mL/L CO2培养箱）培养455 h。收集细胞, 以荧光素mAb标记后, 用流式细胞术分析CD4+、 CD8+ T细胞内IL2、 IFN和TNF的表达。结果: CD4+和CD8+ T细胞内细
7、胞因子的表达, 随着刺激剂的不同而有所差别, 且在上述4种培养环境中, PMA的刺激效果最强, 抗CD3 mAb次之, PHA的刺激效应最弱。以上述3种刺激剂刺激后, 不同培养条件对T细胞内细胞因子的表达有一定的影响。室温培养时几乎检测不到细胞因子的表达, 而在37水浴、 37培养箱和37 50 mL/L CO2培养箱中培养时, 表达细胞因子的CD4+和CD8+ T细胞的百分率差异无统计学意义（P0.05）。结论: 不同刺激剂体外刺激T细胞表达细胞因子的效应不同,依次为PMA和离子霉素抗CD3和抗CD28 mAbPHA。体外刺激培养的T细胞活化过程中, 温度是重要的条件, CO2无明显影响。关
8、键词流式细胞术; T细胞亚群; 细胞因子; 刺激剂; 培养条件应用荧光素标记的抗细胞表面抗原的单克隆抗体（mAb）和抗细胞因子的mAb, 流式细胞术不仅可检测单个细胞内的多种细胞因子, 还可区分表达特定细胞因子的细胞亚群1。但该技术涉及的环节较多, 因此, 需对各方面的影响因素进行探讨。我们曾分析了刺激时间和固定破膜剂等因素对该方法的影响2, 但对于不同刺激剂和不同培养环境对细胞内细胞因子表达的影响尚未见报道。为此, 本研究中分析了3种刺激剂（PHA, 抗CD3和抗CD28 mAb, PMA和离子霉素）以及4种培养环境（室温, 37水浴, 37培养, 37 50 mL/L CO2条件下培养）对
9、CD4+和CD8+ T细胞内细胞因子表达的影响。本研究可为在没有CO2培养箱的条件下, 用流式细胞术检测细胞表面和细胞内的细胞因子提供实验依据, 同时为流式细胞术检测的标准化奠定了基础。 1 材料和方法1.1 材料 PerCP标记的抗CD8 mAb（PerCPantiCD8 mAb）、 APC标记的抗CD4 mAb (APCantiCD4 mAb)、 PE标记的抗TNF mAb (PEantiTNF mAb)、 PE标记的抗IL2 mAb（PEantiIL2 mAb）、 FITC标记的抗IFN mAb (FITCantiIFN mAb)及匹配的同型对照mAb抗体, 均购自美国BD公司。佛波酯（
10、PMA）、 离子霉素(Ionomycin)、 布雷杆氏菌素A（BFA）、 皂苷(Saponin)等, 均购自Sigma公司。鼠抗人CD3和抗CD28 mAb购自美国BDPharMingen公司。RPMI1640培养液和Hanks液购自GIBCO公司。葡聚糖泛影葡胺（Ficollhypaque）购自上海华精生物科技公司。BD FACScalibur 流式细胞仪为美国BD公司产品。CO2培养箱为美国RS Biotech公司产品。1.2 方法1.2.1 PBMC的分离及刺激培养 抽取5例健康体检者（男3例, 女2例, 平均年龄28岁）的静脉血各10 mL, 肝素抗凝后, 加Hanks液稀释, 用淋巴
11、细胞分离液进行密度梯度离心（于22以800 g离心20 min）。吸取上、 中层界面的白色云雾状层, 即为PBMC。充分洗涤后, 计数, 用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬PBMC, 并调整细胞的密度为2109 /L。将细胞分为3份, 分别加入不同的刺激剂PHA（终浓度为5 mg/L）、 抗CD3和抗CD28 mAb（终浓度分别为0.2 mg/L和1 mg/L）、 PMA和离子霉素（终浓度分别为25 g/L和1 mg/L）, 同时加入终浓度为10 mg/L的蛋白转运抑制剂BFA。充分混匀后, 再将每份细胞分为4份, 分别置于室温、 37水浴箱、 37培养箱及37 50
12、 mL/L CO2培养箱中培养4.55 h。1.2.2 细胞表面和细胞内细胞因子的染色 收集培养的PBMC, 用PBS洗涤2次, 每管加入固定剂40 g/L多聚甲醛2 mL, 振荡混匀后, 放置室温中固定8 min。固定后, 每管加入3 mL PBS洗两次。去上清, 加入200 L含有皂苷的缓冲液作用过夜。吸取100 L细胞悬液, 分别加入10 L不同荧光素标记的抗CD8、 抗CD4、 抗IFN、 抗TNF或抗IL2 mAb, 轻轻振荡混匀, 于4避光反应30 min。孵育结束后, 加入3 mL PBS洗涤细胞, 去上清, 每管加入0.5 mL 10 g/L多聚甲醛固定液固定后待测。1.2.3
13、 流式细胞术分析 打开流式细胞仪的双激光光源, 首先设门于淋巴细胞（图1A）, 再以CD4+和CD8+ T细胞设门（图1B）。FL1和FL2荧光通道则以相应的同种型小鼠IgG染色的细胞作阴阳性的分界线, 仔细设置各荧光通道之间的荧光补偿, 然后检测CD4+ 和CD8+ T细胞中表达细胞因子的T细胞的百分率（图1C, 图1D）。收集细胞2000030000个, 并用CellQuest软件分析结果, 数据用SPSS12.0统计软件进行处理。图1 在PMA刺激下, 4种培养环境培养的T细胞中3种细胞因子的表达（略）Fig 1 Expression of 3 cytokines in CD4+ and
14、 CD8+ T cells cultured under the conditions of 4 different cultures after PMA stimulationFSC: Forward scatter; SSC: Side scatter. R1: Lymphocytes; R2: CD8+ T cells; R3: CD4+ T cells. The numbers in the density plot are the percentage of cytokineproducing cells among CD4+ (C) and CD8+ (D) T cells. A:
15、 Density plot of FSC vs SSC allows identification of lymphocytes; B: Density plot of CD8 vs CD4 allows identification of CD4+ and CD8+ T cells; C: Expression of 3 cytokines in CD4+ T cells; D: Expression of 3 cytokines in CD8+ T cells. RT: Room temperature; WB: Water bath.2 结果2.1 不同的刺激剂和培养环境对细胞因子表达的
16、影响 在PMA + 离子霉素刺激下, 于室温中培养的CD4+ T细胞（图1C）和CD8+ T细胞（图1D）均不表达TNF、 IL2和IFN; 而在37水浴、 37培养箱和37 50 mL/L CO2培养箱中培养的条件下, CD4+ T和CD8+ T细胞均表达上述3种细胞因子。但表达这些细胞因子的CD4+和CD8+ T细胞的百分率不同。CD4+ T细胞高表达IL2、 低表达IFN; 而CD8+ T细胞高表达IFN、 低表达IL2。另外, 不同的刺激剂对CD4+和CD8+ T细胞表达细胞因子的影响不同。结果表明, 与PHA相比较, PMA+离子霉素刺激后, IL2、 IFN及TNF的表达最高, 其次为抗CD3+抗CD28 mAb。另外, 不同温度条件下培养对细胞因子的表达也有影响。在室温条
