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1、蛋白质的定量测定微量凯氏定氮法(micro Kjeldahl method)生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.实验原理生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因
2、而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。3. 滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。HClNaOHNaC
3、l +H2O本法适用于0.2 2.0 mg的氮量测定。1.热源 2. 烧瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5玻璃杯 6. 棒状玻塞 7. 反应室 8. 反应室外壳 9. 夹子 10. 反应室中插管 11.冷凝管12. 锥形瓶 13. 石棉网微量凯氏蒸馏装置示意图试剂和器材一、试剂浓硫酸；30过氧化氢溶液；10 M氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg氮/mL）催化剂：硫酸铜：硫酸钾1：4混合，研细。指示剂：0.1甲基红乙醇溶液。二、测试样品牛血清白蛋白。三、器材微量凯氏定氮仪；移液管1mL（3）；2mL（1）；微量滴定管5mL（1）;烧杯200mL（2）；量筒10mL（1）；三角烧
4、瓶150mL（4）；凯氏烧瓶50mL（4），吸耳球（1）；电炉；分析天平。操作方法一、样品处理称取牛血清白蛋白50mg，加入2个凯氏烧瓶中，另2个凯氏烧瓶为空白对照，不加样品。分别在每个凯氏烧瓶中加入约500mg硫酸钾硫酸铜混合物，再加5 mL浓硫酸。二、消化将以上4个凯氏烧瓶置于通风橱中电炉上加热。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化,使瓶内液体微微沸腾，大约维持2 3h。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30过氧化氢溶液1 2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明
5、淡蓝绿色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。三、蒸馏1. 蒸馏器的洗涤蒸气发生器中盛有加有数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤10分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有5mL 2硼酸液和1 2滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏1 2分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。2. 消化样品及空白的蒸馏取50mL 锥形瓶数个，各加25mL 0.01M标准HCl和1 2滴指示剂，用表面皿覆盖备用。取2
6、mL 稀释消化液，由小漏斗加入反应室。将一个装有0.01M标准HCl和指示剂的锥形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。用小量筒量取5mL 10M NaOH溶液，倒入小漏斗，让NaOH溶液缓慢流入反应室。尚未完全尽时，加紧夹子，向小漏斗加入约5mL蒸馏水，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。加热水蒸气发生器，沸腾后，关闭收集器活塞。使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反应生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸馏完全，移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用少量蒸馏水冷凝管口。取下锥形瓶，以0.01M NaOH标准溶液滴定。记下所耗去的体积。3. 蒸馏后蒸馏器的洗涤蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发
7、生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。 标准样品的测定在蒸馏样品及空白前，为了练习蒸馏和滴定操作，可用标准硫酸铵试做实验2 3次。标准硫酸铵的含氮量是0.3mg/mL，每次实验取2.0mL。四、计算样品的含氮量（mg/mL）=若测定的蛋白质含氮部分只是蛋白质（如血清），则：样品中蛋白质含量（mg/mL）式中：A为滴定空白用去的NaOH平均mL数，B为滴定样品用去的NaOH平均mL数，V为样品的mL 数，0.01 NaOH的摩尔浓度，14为氮的原子量，6.25为系数（蛋白质的平均含氮量为16，由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数6.25即为蛋白质量），N为
8、样品的稀释倍数。注意事项（1）必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。（2）凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。（3）小心加样，切勿使样品沾污口部、颈部。（4）消化时，须斜放凯氏烧瓶（45o左右）。火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上。（5）蒸馏时，小心加入消化液。加样时最好将火力拧小或撤去。蒸馏时，切记火力不稳，否则将发生倒吸现象。（6）蒸馏后应及时清洗定氮仪。植物体内可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法)考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在59
9、5nm。在一定蛋白质浓度范围内（0100g/ml），蛋白质色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。【原理】考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后
10、者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0100g/ml），蛋白质色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。【仪器与用具】分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。【试剂】（1）牛血清白蛋白 配成1000g/ml和100g/ml；（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙
11、醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月；（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。【方法】1.标准曲线的绘制（1）0100g/ml标准曲线的制作取6支试管，按表28-1数据配制0100g/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。表28-1配制0100g/ml血清白蛋白液管号123456100g/ml牛血清蛋白量(ml)蒸馏水量(ml)蛋白质含量(mg)01.000.20.80.
12、020.40.60.040.60.40.060.80.20.081.000.10（2）01000g/ml标准曲线的制作另取6支试管，按表28-2数据配制01000g/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出01000g/ml的标准曲线。表28-2配制01000g/ml血清蛋白血液管号7891011121000g/ml牛血清白蛋白（ml）蒸馏水量(ml)蛋白质含量(mg)01.000.20.80.20.40.60.40.60.40.60.80.20.81.001.02. 样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管
13、），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。3. 结果计算样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=式中C查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V提取液总体积（ml）；a测定所取提取液体积（ml）；W取样量（g）。蛋白质含量的测定考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）染色法考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目
14、前灵敏度最高的蛋白质测定法。实验原理考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝
15、染色法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Tri
