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1、残留效应名词解释、前言残留(carryover)和污染(contamination)有多种不同的定 义。在色谱分析中，残留经常是评价厂家仪器质量优劣的一个考核 指标。当所有的死体积都已经被考虑了，残留主要是工程设计和进 样系统相关的函数。它是由于前一个样品中的被测物少量滞留于系 统“死”体积中并被引入到下一个进样的样品，或者是由被测物在 进样系统中的吸附而造成的现象。污染可定义为空白基质及实验对照组，给药前及安慰剂组样品 中出现待测物的峰。污染也可能出现于校正标样、质控样品及实际 样品中，但由于这些样品中含有待测物，使得污染较难被检测。污 染也可能由和待测物在保留时间及质谱特征上极其相似的不明
2、来源 其它物质产生的“峰”造成。相对于残留，污染具有更多的随机性 和多源性，这使它更难以被诊断和纠正。二、法规要求(一) 残留效应2015版中国药典中规定：应该在方法建立中考察残留并使 之最小。残留可能不影响准确度和精密度。应通过在注射高浓度样 品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空 白样品中的残留应不超过定量下限(LLOQ)的20%，并且不超过内 标的5 %。如果残留不可避免，应考虑特殊措施，在方法验证时检 验并在试验样品分析时应用这些措施，以确保不影响准确度和精密 度。这可能包括在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试 验样品。FDA 在 2018 年 05 月颁布
3、的生物分析方法验证指导原则中 要求：研究样品的残留应该被评估，残留不应超过20%的定量下 限。EMA在2011年的生物分析方法验证指南中表明残留评估可通过 在一个高浓度或定量上限（ULOQ）校正曲线点后分析空白样品来获 得。这个空白样品中，残留的响应值应不超过LLOQ的20%,内标残 留的响应不超过5%的常规内标响应。（二）污染通过设定不包括空白样品（不含分析物和内标的处理过的基质 样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质），进行评价潜在干扰 的来源，方法严重不存在干扰峰不能保证样品分析中就没有污染。 此外，待测物的污染可能发生在试剂和空白基质中（处理过的和未 经处理的）。FDA更关注的是污染
4、对LLOQ的影响。根据指导原则，校正曲线 的最低浓度作为LLOQ应满足以下条件：1、分析物在LLOQ的响应值是空白样品响应值的5倍以上；2、分析峰可辩、清晰、可重复、精密度20%以内、准确度 80%120%；3、对于选择性而言，应有证据证明测定的物质是指定的分析 物；4、方法特异性应用至少6 个毒理的同种基质来建立。三、残留和污染的评估（一）残留的评估残留可划分为三类：（1）传统意义上的或真正的残留，主要来自于系统的设计；（2）由吸附导致的残留；（3）由不完全洗脱形成的残留。残留影响的估算，对固定的残留：残留影响百分比（ECI%）=RCXCRX100相对残留（RC）二空白中峰面积/前行样品峰面
5、积X100浓度比（CR）二前行样品浓度/后续样品浓度X100非传统意义上的残留如果由吸附造成，仅会在数个或多个样品 进样后出现。质谱检测器本身也可能由一种被称作“串扰”的现象 而导致残留。这种现象有离子不能及时从碰撞室中移走而产生。当 在“旧”的质谱仪器上使用选择反应监测（SRM）检测多个分析物且 停留时间短时，可能会产生这个现象。（二）污染的评估污染可分为三大类，如下所示：（1）样品在储存中和样本制备前被分析物污染。它与从人体/ 动物取样到样品转移至样品管的过程有关。（2）样品在准备过程中被分析物污染。是指样品在分析前的处 理中如提取及在进样器上放置时产生的。（3）有表现像待测物的未知化合物
6、造成。这些污染物可能导致LC-MS/MS 离子一直或偶尔增强。此外，前面分析样品中保留长物质 也会造成污染。无论临床前或临床样品，污染可有空气因素、采样失误、转移 和运输、不干净的容器和试剂、内标同位素纯度不足造成。从实验 的操作来看，污染可产生于样品的采集过程中。如在临床或动物房 及生物分析实验室。1、空气中的污染空气中的污染可有很多因素导致。样品制备过程的溶剂挥发会 产生外溅及气溶胶，其程度与96 孔板的形状和挥发温度有关。使用手动和自动的液体工作站时，气流可影响转移的过程。许 多因素，包括通风厨和空调气流力度与方向的影响都可在实验室设 计时予以解决。如果控制不好会造成各类污染，特别是待测
7、化合 物。2、给药、样品采集及储存过程的污染污染可能发生在生物分析实验室之外，如动物房和临床中心， 由于给药或采集操作失误。给药失误有许多可能性。例如，待测药 物给了对照组的动物或安慰剂组的人，或者对照组的药剂被待测药 物或高剂量被当低剂量使用。环境因素也会导致污染，如喂食在不 同笼中小鼠/大鼠时产生失误。同样地，对照组和给药组的动物接触 时由于互相舔黏有食物的皮毛而污染。临床前样品和临床样品的污染可发生在样品采集和储存的任何 环节。例如，样品会被错误的指示（对照组与给药组互换）或在红细胞（RBC）分离血浆时重复使用一次性的滴管。冻存前不正确放置血浆样品造成交叉污染（例如，由水平而不是垂直放置
8、导致样品管 的泄漏）。3、样品准备中的污染如果没有认真对待，一下的样品准备及分析步骤（AP）会出现污染问题，常见问题如下。（1）样品弄混：分析了错误的样品。（2）样品转移/取样：样品放入错误的管孔。（3）仪器污染：待测物吸附到分析仪器的表面。（4）重复使用一次性实验器皿。在LC-MS分析中，应尽量使用 一次性的试验器皿，移液器的枪头和容器用后应扔掉。有时，因为 某些原因这些会被重复使用。（5）飞溅及溶液爬壁。常见的“飞溅”问题是有枪头和液体表面的远距离造成。特别 是对于低黏度的液体，有时候尽管可以在移液工作站吸液后可以吸 一段空气泡，但这仍然是常见的污染问题。如果吹干用的氮气探针 与液体表面太
9、近或氮气的压力太大，迸溅也会发生在96孔板液体干 燥的过程中。另一个在溶剂吹干过程中常见的问题是，如果氮气流 速和温度不合适，易挥发溶剂会产生爬壁现象。4、试剂污染有时候待测化合物意外加入到试剂中也会造成污染。当这种情况发生时，待测化合物会出现在一个特定分析批的所有样品中，如 空白、校正标样、QC及实际样品。在样品制备和色谱中使用频率最 高的溶剂应该是水。水质不一定是水能否在 LC-MS 中使用的指标， 然而定义水的纯度对数据记录及追溯是必需的。从储存容器、采样 管、流路中产生的有机提取物是另一个污染源。这些干扰物质包括 增塑剂、洗涤剂、润滑剂和用于校正质谱的聚乙二醇（PEG）。5、内标污染化
10、学同系物依然是内标的传统选择，但是鉴于EMA的推荐，稳 定同位素标记（SIL）的化合物作为内标则更加流行。化学同系物内 极少会含有与待测物相似或同时出峰的杂质。然而，如需在同一分 析批次中同时分析代谢产物的话，这些内标因其合成过程中会产生 一些与代谢物相似的杂质而经常会引起问题。同位素标记的化合物 可能因制备过程的不完善而含有大量未标记的化合物。彻底去除这 些未标记的化合物并不容易，因此方法的使用者应设法保证任何新 一批的同位素标记内标不会影响到 LLOQ。四、各大仪器厂商应对策略通过对仪器设计进行优化，以减少残留的因素是各大仪器厂家 孜孜不倦去追寻的目标。进样系统的设计是控制一般残留的主要着
11、 眼点。例如，进样针是否从指定的样品管取样并注射到进样阀或进 样针是否与液相色谱流量串接，这样液相流动相能从中通过。生产 厂家致力于减轻残留的做法之一是减少系统的死体积，同时会考虑 控制吸附和开发合适的淋洗液。然而依靠生产厂家解决所有类型化合物的吸附是不可能的。事 实上，尽管不锈钢系统对一些化合物吸附很小，应用中依然需要使 用聚合物管线和进样阀来减少其它化合物的吸附。虽然大多数的残 留与进样系统相关，柱材料上（如填充材料、柱头滤芯）的吸附可 能会很严重。四大仪器厂商对这些问题的考虑与解决方法如下所 示：（一）岛津（Shimadzu）岛津公司新一代的液相系统，Nexera/SIL-30ACMP号
12、称是比同类系统的残留更小且进样周期更短。新的系统减少了接触面积，使 用了特殊涂层和表面处理加上新的密封圈。（二）沃特世（Waters）Waters最新的超高压液相色谱仪型号是Acquity UPLC I-class，该系统号称比其先前系统的残留地，因而会增加质谱的灵敏 度及校正范围。另一款新开发的仪器是H-Class Bio，它的超纯化 系统为生物大分子分析中污染及残留的问题提供了选择。（三）安捷伦（Ag订ent）安捷伦1290 Infinity LC及LC-MS系统，是利用进样针座反冲来消除系统相关残留的技术。液相部分残留的来源安捷伦公司解剖 如下：（1）针与毛细管材料的吸附；（2）针的设计
13、、密封或磨损部件（死体积和吸附）；（3）阀上转子、设计、磨损（死体积主导的吸附）；（4）毛细接口失调（所有节点都会被污染，增加死体积）；5）样品柱上死体积与接口和节点的吸附及固定相与样品的结（四）赛默飞（Thermo Scient if ic）Thermo开发了 Accela Open自动进样器，样品可以保存在进样 针和进样孔之间。利用软件可控制两个溶剂来清洗整个流路。五、生物分析中残留和污染的控制和解决方案（一）残留和污染的识别及确认残留可以通过在高浓度的标准或QC样品之后分析空白基质来评 估。另外，可在分析批的起始分析数个基质空白来确认样品分析之 前系统干净无污染。同时，也将空白基质置于分
14、析批的其它位置（ULOQ校正标样或高浓度QC样品之后）来监控分析过程的残留影 响。试剂空白和溶剂空白也可以用来监控分析过程的残留。如果最 高浓度校正标样后的空白信号超过了 LLOQ的20%或其内标超过类常 规内标响应的5%，则可确定有严重的残留问题。同样地，污染的存在也可通过检测机制空白、试剂空白和溶剂 空白中化合物或内标的存在来判断。分析批中给药前、对照组或安 慰剂组样品需检查化合物存在与否。如果这组样品中任何一个出现 超过LLOQ的峰，分析中可能出现了污染。前面已经提到常见残留可 能产生的原因。此处需要特别提出的是，对于肽类及蛋白类样品产 生残留效应的原因主要有以下几点：1、样品的非特异性
15、吸附作用残留效应是指色谱分析中，在高浓度样品后进样空白样品仍然 有分析物信号出现。残留效应是由于残存的检测物质不可逆的吸附 在系统中引起的。超过10 个氨基酸组成的肽称为多肽，大于50 个 氨基酸的多肽被归类为蛋白质。肽类或蛋白类药物分子与容器表面 相互作用在很大程度上取决于分子的大小和其特定的氨基酸侧链。氨基酸分子具有两性的行为特点，它们可以带一个或几个正/负 电荷，如果所带正负电荷总量相等，可以视为中性分子。通常，带 正电荷的肽类及蛋白类分子易与带负电荷的玻璃表面发生静电作 用，而中性的肽类及蛋白类分子会与疏水性材料聚丙烯发生疏水性 相互作用。这样，肽类及蛋白类药物易吸附于容器壁、吸管端及
16、检 测系统中。而样品稀释剂溶解性差是引起灵敏度下降、非线性行为 和重复性差的主要原因。尽管使用稳定的同位素内标能够纠正后两 个问题，但不能纠正由于吸附造成的肽损失。2、质谱检测灵敏度的影响新一代质谱仪检测器的灵敏度不断提高，检测限低于pg/mL的 范围，所用标准曲线动态范围大于 104 数量级，这将大大增加方法 开发中残留效应出现的风险。（三）残留或污染的消除策略1、样品进样前的残留部位及消除策略在样品制备阶段，吸附现象可以发生在移液管头、离心管中。 因为固体表面积结合容量有限，在低浓度溶液中，蛋白多肽类样品 的相对吸附损失程度较高。因此，吸取样品前要充分润洗移液管 头。而样品吸附程度主要取决于溶剂和表
