转化和转染

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1、转化和转染一、转化转化(transformation)是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细 胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。该现象首先发现于细菌。 1生物转化简介细胞转化(transformation)是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细 胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。这现象首先发现于细菌，也是细 菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种，它不同于通过噬菌体感染传递遗传物质 的转导以及通过细菌细胞的接触而转移DNA的细菌接合。病毒转化的研究不但在理论上有重要意义，而且在基因工程中是将质粒或病毒载体引入宿 主细胞的一种重要手

2、段(见重组DNA技术)。它也可能为育种和遗传性疾病的基因治疗 提供新的途径。球菌转化现象1928年英国学者F.格里菲思在肺炎双球菌中发现的。他把不产荚膜的无 毒的粗糙型肺炎双球菌和加热杀死后的产荚膜的有毒的光滑型肺炎双球菌混合注射小鼠, 发现小鼠意外地被感染致死，而且从小鼠的血液中分离出活的产荚膜的肺炎双球菌。不久 又发现产荚膜细菌的无细胞抽提物同样能在试管中使不产荚膜的细菌变为产荚膜的细菌。 1944年美国细菌学家0. T.埃弗里等从元素分析、酶学分析、血清学分析以及生物活 性鉴定等方面证实了无细胞抽提物中引起肺炎双球菌荚膜转化的转化因子是脱氧核糖核 酸(DNA)，第一次为遗传物质是DNA而

3、不是蛋白质提供了直接的证据。到目前为止， 已经在流感嗜血杆菌(Hemophilus in flue nzae)、链球菌(Streptococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、奈瑟氏菌(Neisseria)、根瘤菌(Rhizobium)、枯草杆菌(Bacillus subti-lis)、大肠杆菌(Escherichia coli)等几十种细菌中报道了转化现象，所转化的性 状包括荚膜、抗药性、糖发酵特性、营养要求特性等等。它们的转化因子都是DNA。 2细菌的转化染色体转化过程包括有转化能力的染色体DNA片段的吸附、吸收和整合3个阶段。外源 DNA首先吸附在细菌细胞表面的一些接受位点上。肺

4、炎双球菌和枯草杆菌等细胞的接受 位点没有专一性，它们能吸附同种的DNA，也能吸附大肠杆菌的DNA。流感嗜血杆菌的 接受位点则只能吸附近缘细菌的DNA。DNA在和细菌刚接触时可以被洗去，在稳定吸附 以后便不能洗去，但还能被核酸酶水解。DNA被细胞吸收以后便不能被外源的核酸酶水 解。能吸附的DNA主要是双链状态的，在通过细胞膜进入细胞的吸收过程中DNA分子 转变为单链，并以这种形式整合到细菌染色体上。整合过程又可以分5个步骤。外源基因整合后，通过基因表达使受体细菌的表型发生相应的变化。图中所示的转化 模式至少对于肺炎双球菌和枯草杆菌来讲是正确的。质粒质粒DNA的转化和染色体DNA的转化有显著的不同

5、。在一般情况下前者的转化效 率远远低于后者。但如果先用一定浓度的钙离子处理大肠杆菌细胞，再用质粒DNA和染 色体DNA对它做转化实验则情况恰好相反。此外，质粒DNA很容易进入去掉了细胞壁 的细菌的原生质体，说明对它的吸收并不通过专门的接受位点；质粒DNA的转化过程没 有整合这一环节。影响因素许多因素可以影响转化效率。受体细菌和供体细菌的亲缘关系愈远则转化效率愈低, 这主要是受吸附位点专一性和染色体的同源程度的影响oDNA分子的联会是供体DNA整 合到受体DNA上的先决条件，联会一般只发生在同源染色体之间，而亲缘关系愈远则同 源性愈低，所以转化效率也愈低。但细菌间染色体的某些部位如核糖体基因部位

6、在进化过 程中很少发生变化,而有些性状如红霉素抗性和链霉素抗性等都是由于与核糖体有关的基 因发生突变而使核糖体蛋白结构改变的结果，所以如果所转化的是红霉素或链霉素抗性基 因或者和它们紧密连锁的其他基因，则转化效率便较少受细菌的亲缘关系的影响。转化效率同一种细菌也可以由于基因型的改变而改变转化效率。细菌的限制性核酸内切酶能够 分解外来的DNA，所以如果用限制酶失活的突变型菌株作为转化受体时可以提高转化效 率。通过筛选也可以得到转化效率显著下降的突变型，包括吸附能力、吸收能力和整合能 力下降的突变型。某些转化效率降低的突变型对于紫外线格外敏感，这一性质也是许多丧 失了 DNA损伤修复能力和丧失重组

7、功能的突变型的特性，可见转化过程中的DNA的整 合和DNA损伤修复以及基因重组都涉及某些相同的酶。基因型完全相同的细菌可以由于生理状态的改变而改变转化效率。能够吸收外源 DNA的生理状态称为感受态。许多细菌的感受态都在对数生长期的后期迅速出现，经过 一段时间以后便消失。感受态的细菌和非感受态的细菌相比，转化效率可以高出万倍。 种族特异从处于感受态的肺炎双球菌和链球菌中曾分离出感受态因子。感受态因子是蛋白质, 它能使非感受态细菌转变为感受态，并有一定的种族特异性。某些外界因素可以影响转化效率，例如一定浓度的钙离子能够提高大肠杆菌、流感嗜 血杆菌、金黄色葡萄球菌等的转化效率。又例如流感嗜血杆菌吸收

8、双链DNA分子的最适 pH是6.8， pH下降到5.5以下便不能吸收。温度对于转化也有影响，在肺炎双球菌和 嗜血流感杆菌中外源DNA的整合在一定范围内都随着温度的上升而提高。细菌的转化多数是在人为条件下进行的。在自然条件下已经知道肺炎双球菌的转化可 以在小鼠体内进行，奈瑟氏菌细胞自溶所释放的DNA可以转化周围的细胞。细菌转化的 生物学意义还有待于进一步研究。在不能或不易通过细菌接合或转导作遗传学分析的细菌 中，转化可以作为一种研究的手段。蛋白质转染是转化的一种特殊形式，是用除去蛋白质外壳的病毒（包括噬菌体）核酸感染细 胞或原生质体的过程。与一般的转化过程的区别在于：转染过程中进入细胞的是完整的

9、 病毒DNA，而通过转化进入受体细胞的则是染色体DNA的片断或质粒DNA:转染过 程中病毒DNA 一般不整合到染色体上，但转化过程则往往涉及DNA的整合；转染效 果可用单位量的DNA引起的病斑或噬菌斑的多少来表示，转化效果则用一定量的DNA 所带来的被转化的受体细胞菌落数目来表示。3大肠杆菌转化实验材料准备1. 器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml微量离心管，双面微量离心管 架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp）， 超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。2. 试剂培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH20,

10、 IPTG, X-gal。3. 材料处理无菌ddH2O，1.5 ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭 菌），20%IPTG （M/V）, 2% X-gal （M/V,用 N,N-二甲基甲酰胺配）。操作步骤1. 事先将恒温水浴的温度调到42C。2. 从-70C超低温冰柜中取出一管（100 pl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入 冰上，冰浴510 min。3. 加入5 pl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰 上 20 min。4. 轻轻摇匀后插入42C水浴中12 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置35 mi n。5. 在超净工作台

11、中向上述各管中分别加入500 pl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混 匀，然后固定到摇床的弹簧架上37C震荡1 h。6. 在超净工作台中取上述转化混合液100-300 pl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40 pl 2% X-gal，8 pl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。8. 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37C恒温培养箱中3060 min直到表面 的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37C恒温培养箱过夜。9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦

12、干桌面，写实验报告。10. 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。1 4真核生物的转化在酵母菌、脉抱菌和植物细胞中转化的主要障碍是细胞壁。把细胞壁用酶消化后便能 有效地转化。高等动物细胞的转化大多是在离体培养细胞中发现的，例如小鼠细胞、鸡胚 细胞和人的海拉细胞等，这些细胞常以胞饮方式摄取物质。使供体DNA形成磷酸钙沉淀 能显著地提高转化效率。由于高等动植物细胞的转化频率远远低于细菌，因此一个转化实 验能否成功在很大程度上取决于选择性培养基和选择性标记的恰当使用。例如在一个哺乳 动物细胞的转化系统中，用取自疱疹病毒（HSV）的胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因DNA 去转化

13、相应的缺陷型细胞TK-，并用HAT培养基来筛选有TK+基因标记的转化细胞便能 成功（见体细胞遗传学）。在同一转化系统中，如果把大量没有选择性标记的DNA混合 少量有TK基因选择标记的DNA去转化TK-细胞，这样得到的TK+细胞中将有一小部分 也为无选择性标记的DNA所转化，这种现象称为共转化。在高等动物中虽然现在还不能进行活体的转化，但可以把转化细胞注射到活体中，使 它们取代活体中未转化的细胞。例如可以用抗氨甲蝶吟的小鼠细胞株的DNA片段转化体 外培养的小鼠骨髓细胞（这些细胞有特定的染色体标记，易于与受体小鼠的骨髓细胞相区 别），然后把转化的骨髓细胞注入受体小鼠的骨髓。在一段时间后这些小鼠的骨

14、髓中可以 检出抗氨甲蝶吟的细胞。如果为接受注射的小鼠经常注射氨甲蝶吟，随着饲养时间的推移 可以看到带有特定染色体标记的细胞的百分数逐渐增加，此种情况说明抗氨甲蝶吟的细胞 经过细胞分裂增殖而部分地取代了未转化的细胞。这样的工作显然是向基因治疗这一目标 跨出的第一步。在高等植物中某些体细胞能在一定的培养条件下生长成完整的植株，因此 便有可能通过转化培养细胞培育成不同基因型的新种植株。在真核生物的细胞生物学研究中，转化这一名词还有另一种意义，这就是由致癌的 RNA或DNA病毒感染真核细胞引起的细胞癌变现象。进入细胞的病毒基因组DNA往往 整合到被转化的细胞的染色体上。为了明确起见，这种转化有时又称为

15、细胞转化。二、转染转染（tra nsfectio n）指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规 转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。1简介转染（tra nsfectio n）指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者 外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高 水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺 旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果， 常常用到一些

16、报告系统如荧光蛋白，0半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外 源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线 性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约 1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶APH；新霉 素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定 转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比 例，细胞数量，培养及检测时间等。2分类 化学包括：1.DEAE-葡聚糖法，2磷酸钙法，3人工脂质体法。DEAE-葡聚糖是最早应用 哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后 接近细胞膜而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染成功