细菌的简单染色和革兰染色实验报告生 32 程雨婧 2013012406一、实验目的1、学习无菌操作技术，掌握细菌涂片的制备方法2、巩固显微镜油镜的使用方法3、掌握细菌简单染色法和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果二、实验原理细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染 料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色当细菌分解糖类产酸时，细菌所 带正电荷增加易被带负电荷的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色简单染色法就是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法革兰氏染色法（Gram Staining）由丹麦病理学家Christian Gram于1884年创立， 是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别分类为革兰氏阳性 菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）这两种类型，是细菌学中最常用的鉴别性染色法革兰氏染色法之所以能够将细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-） 两大类，是因为这两类菌的细胞壁结构和成分不同一般认为革兰阴性细菌的肽聚糖层 很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔 径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色，再经番红复染就 染成了红色；革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径 缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色。
除此之外，革兰染色的差异还应考虑物理结构的不同，例如酵母菌虽然是不是细菌， 既不是革兰氏阴性菌，也不是革兰氏阳性菌，但具有革兰染色阳性反应三、实验器材1、 菌种：大肠杆菌、枯草芽抱杆菌、葡萄球菌、酵母菌、待鉴定的未知菌S1和S22、 仪器及其他用品：显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、盖玻片、擦镜纸、 擦镜液、吸水纸、镜油、无菌牙签3、 简单染液：结晶紫染液、番红染液4、 革兰染液：结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番红染液四、实验步骤（一）简单染色1、 载玻片的处理：从乙醇溶液中取出洗干净的载玻片，用吸水纸擦干，将要涂菌 的部位在酒精灯火焰上烤一下，可以去除油脂，冷却待用2、 涂片: 左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上灼烧待冷却后，用接种环从试 管枯草芽抱杆菌培养液中取一环菌，于载玻片中央涂一直径约0.5-1cm的均匀薄层（可 以事先在背面做好标记圆圈），或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上 挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一均匀薄层取菌时应在酒精灯火焰外焰 附近操作，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌3、 干燥：涂片后室温下自然干燥4、固定：手持载玻片一端使标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动2~3 次，要求玻片温度不超过60°C,以玻片背面触及手背皮肤觉得较热即将感觉到烫为宜， 放置待冷后染色。
固定的目的是杀死微生物，固定其细胞结构，保证菌体能牢固地粘附 在载玻片上，以免水洗时被水冲掉5、 染色：在固定好的涂片标记处滴加1滴结晶紫染液，染色lmin6、 水洗：缓慢冲洗染液，吸干7、 镜检：观察两个标本，区分辨别染成的紫色和红色8、 将枯草芽孢杆菌改为平板上的大肠杆菌，重复以上步骤（二）革兰染色1、 制片：分别取大肠杆菌、枯草芽抱杆菌、葡萄球菌、酵母菌、未知菌S1制成涂 片，干燥，固定2、 初染：滴加1滴结晶紫染液，染色1min，水洗，吸干3、 媒染：再加1滴碘液覆盖涂片1min，水洗4、 脱色：用吸水纸吸去载玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片 直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗5、 复染：滴番红染液复染3min，水洗6、 镜检：吸去多余的水后，盖上盖玻片观察标本，观察时注意细菌形态、大小、 排列和颜色三）选做实验在干净的载波片上滴加半滴水，用无菌牙签取一点牙垢，涂抹在水滴上，制成涂片 后，进行革兰氏染色后观察五、实验结果与讨论1、革兰染色照片结果（1）枯草杆菌图1枯草杆菌革兰氏染色结果，10x100如上图所示，枯草杆菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）2）酵母菌注：样品为酵母菌液，背景中可见大肠杆菌污染图3酵母菌革兰氏染色结果2,10X100如上图所示，酵母菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）。
注：样品为固体平板上的酵母菌3）金黄色葡萄球菌图4金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,10x100如上图所示，金黄色葡萄球菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）注：从图中可以观察到葡萄球状的细菌聚集状态4）大肠杆菌图5大肠杆菌革兰氏染色结果,10x100如上图所示，大肠杆菌染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G—5）未知菌液 S1图6未知菌液S1涂片革兰氏染色结果,10x100如上图所示，未知菌的染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）,由细菌形态推测为一种球菌6）牙垢图7 牙垢涂片中微生物染色结果， 10x100如图所示，牙垢中含有多种细菌，多数染色为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）,图中可见一些球菌和杆菌2、革兰染色观察结果列表菌种鉴定结果细菌颜色细菌形状（形状和聚集状态）枯草芽抱杆菌G+邙日性）紫色杆状菌，较分散，个别聚集成链状酵母菌G+邙日性）紫色球状菌，团状聚集金黄色葡萄球菌G+邙日性）紫色球状菌，葡萄球状聚集大肠杆菌G-（阴性）红色短杆状菌，分散排列S1未知菌种G+邙日性）紫色球状菌，较分散3、思考题（1）分析影响某一微生物革兰染色结果的因素操作因素① 载玻片应清洁无油脂，可以在酒精等火燃上烤一下以去除油脂。
② 涂片太厚，在涂片时细菌挑的太多，没法分开，在脱色时就不能将第一步染上的结晶 紫 的颜色脱去，可能会使革兰阴性菌也出现紫色，误认为革兰日性菌③ 脱色时间，阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色；但这是在固定的时 间条件下的结果，如果延长脱色时间，也会使脱色剂渗透进日性菌的细胞壁中，使染上 的结晶紫脱去颜色，最后染上复红的颜色，变成革兰阴性菌 而脱色时间太短的话又 会使阴性菌染上的结晶紫不能完全脱色， 出现紫色，误认为革兰阳性菌④ 固定方法，固定不仅能杀死细菌，改变细菌对染料的通透性，还能使细菌吸附在玻片 上，保持原有的形态结构固定方法是将干燥后的细菌涂片以中等速度通过火焰三次， 以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜但在实际操作中可能因为将玻片在火焰上烤的太久， 改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生变化影响了染色的结果⑤ 初染色时间应控制在30s~lmin为宜如果染色时间过短，不利于初染液结晶紫与细 胞结合,造成阳性菌呈阴性结果而染色时间过长, 不易脱色，易使阴性菌呈假阳性⑥ 脱色时间最好在10~20s，以恰好洗脱液物色为准，如果时间过长，革兰阳性菌也有 可能被脱色, 结果呈假阴性。
而若脱色时间不足, 革兰阴性菌细胞壁的部分类脂质未被 乙醇溶解,使结晶紫-碘的复合物不能被洗脱出来,结果呈假阳性细菌因素① 细菌培养时间，细菌的典型形态、染色性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰染色 可以反应细菌的真实的染色性如果细菌培养时间太长，变成了老龄菌，染色性就会发 生变化，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌② 培养基的成分，一般认为革兰阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物， 它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色 但是如果培养基中缺乏核蛋白质镁盐 就不能合成菌体成分的核蛋白质镁盐，细菌与碘和结晶紫的复合物结合就不牢固，容易 脱色，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌 染液因素①碘液，碘液作为媒染剂能增加染料与被染物的亲和力如果碘液放置时间太长，或经 日光照射失效，失去媒染剂的作用，就可能使结晶紫与细菌结合的不牢固，容易被脱色， 使革兰阳性菌染成革兰阴性菌 ② 结晶紫，结晶紫的浓度太高，就会使染上的颜色不容易被酒精脱色，可能会使革兰阴 性菌染成革兰阳性菌③ 酒精，酒精作为脱色剂，革兰染色的脱色酒精浓度为95%,在此浓度下革兰阳性菌染 上的结晶紫不易被脱去，保留紫色，革兰阴性菌染上的结晶紫容易被脱去，最后呈红色。
但当酒精的浓度为70时，它的脱色能力最强，可能使革兰阳性菌染上的结晶紫也被脱 去，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌综上所述，影响染色的其他因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的 通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用此外，培养基的组 成、菌龄、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染 色，所以我们在染色时要注意当染色结果与预想的结果出现不一致时，要考虑到这些因 素的影响我们应该在开始学习革兰染色，就认真对待，养成良好的学习态度，严格按 照操作规程来做，提高实验结果的准确性2）思考一下，我们平常使用的甲紫药水杀菌机理 龙胆紫为碱性阳离子染料,其阳离子能与细菌蛋白质的羧基结合，从而影响其代谢，对 革兰氏阳性菌有选择性抑制作用，因而产生杀菌作用一般医用的紫药水是龙胆紫的 1%〜2%水溶液或酒精溶液，是常用的外用药对革兰氏阳性菌、绿脓杆菌、及真菌（如 念珠菌以及皮肤癣菌等）有较强杀菌作用，对革兰氏阴性菌和抗酸菌作用不显著对组 织无刺激性六、 实验小结这堂课学习了革兰氏染色方法，由于老师对细节讲解得很到位，实验过程比较顺利虽然对于大肠杆菌菌液的装片，最终还是没有在镜下找到细菌，但通过固体平板上的大 肠杆菌装片，还是看到了大肠杆菌的染色结果。
最后还要感谢陈老师、麻老师和各位助 教的耐心细心的讲解和指导七、 参考文献 陈金春、陈国强主编，《微生物学实验指导》，清华大学出版社，2005年8月 黄静芳，《革兰染色影响因素的探讨》，实用医技杂志，2006 年 3 月。