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1、实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1. 了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2.掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、 放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳 循环。在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌 种需要：1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-8 -D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、 CMC酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解8 -1,4-糖
2、苷键， 将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4- 8 -D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶 （Cellobiohydrolase简称CBH），这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解8 -1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3. B -葡萄糖苷酶（8 -glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维 二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解 很快。随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。只有三种酶的协同 作用，才能较
3、好的分解纤维素。就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高， 产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。本实验以羟甲基 纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微 生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。以羧甲基纤维素 钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚 果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。三、实验仪器及试剂材料土样取自学校校门口小树林520cm深处；仪器试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒
4、精 灯、移液枪、接种环、高压灭菌锅等；培养基（1）筛选培养基（500ml）CMC-Na 10g、（NH4）2SO4 1.4 g、MgSO4 0.3g KH2PO4 2g、MnSO4 1.6mg、FeSO4 5mg ZnSO4 2.5mg、CoCl2 2.0mg琼脂 20gPH7.0（保藏培养基（500ml）CMC-Na 15g、MgSO4 0.5g、K2HPO4 1.5g、酵母粉10gNaCl 5g、蛋白胨15g、琼脂20g、刚果红PH7.0四、实验步骤1. 土样采集取自学校校门口小树林520cm深处；2. 实验器材灭菌：平板、移液管的包扎及灭菌；无菌水的制备：量取99ml自来水于250ml锥
5、形瓶中，并放入适量颗玻璃窗珠，塞上棉塞， 用牛皮纸包扎，于121?C条件下灭菌20min备用。量取9ml自来水于试管中，用试管塞塞 好，用牛皮纸包扎，于121?C条件下灭菌20min备用。筛选培养基配制及倒平板：准确按筛选培养基配方称取各物质溶于1000ml蒸馏水中，调节 pH7.0。在高压来菌锅中于121?C高温灭菌20min，取出于无菌环境旧倒平板备用。保藏培养基配制及摆斜面：准确按筛选培养基配方称取各物质溶于1000ml蒸馏水中，调节 pH7.0。分装试管中，在高压来菌锅中于121?C高温灭菌20min，取出摆斜面备用。土样预处理及梯度稀释（1）样品菌悬液的制备先取1g样品，加入到99ml含有玻璃珠的无菌水中，震荡几分钟形 成悬液。（2）梯度稀释：在无菌条件下，用灭好菌的移液管取1ml到装有9ml无菌水的试管中，依次稀释10 -3、10-4、10-5、10-6的梯度备用7.倒平板涂布分别取10-4、10-5、10-6三个浓度的菌悬液接种到倒好了的平板中，并涂布 均匀
