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1、HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H2b)特异性细胞和体液免疫应答摘要 目的 观察HBcAg DNA疫苗(pJW4303/HBc)免疫C57BL/6小鼠 (H-2b)的特异性细胞和体液免疫应答。方法基因枪和肌肉注射两种方法接种DNA疫苗；ELISA法检测小鼠血清抗-HBc(IgG)及IgG亚类(lgG1,lgG2a) ； 51铬 释放法检测小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性。结果 该DNA疫苗体外可表达 HBcAg小鼠经基因枪或肌肉注射接种该疫苗后血清抗-HBc滴度分别达1 : 328050和1 : 109 350;肌肉注射组抗-HBc亚类以IgG2a为主；两种方法接种小鼠 的特异性CTL杀伤率
2、分别达53.1%和52.8%。结论 HBcAg DNA疫苗在H-2b小鼠 实验中表现出良好的细胞免疫和体液免疫原性。关键词肝炎核心抗原，乙型DNA疫苗小鼠Specific cellular and humoral immune resp on ses in H-2b micein duced by DNA immuni zati on of HBV core geneHUANG Zuh u,LU Sha n, LIU Ni ng,et al.The First Affiliated Hospitalof Nanjing Medical University,Nanjing 210029Abst
3、ract Objective To observe the specific cellular and humoral immune responses in H-2 b mice after DNA immunization of HBV core gen e.Methods The DNA vacci ne(pJW4303/HBc) was con structed by inserting HBV core gene fragment into the reading frame of plasmid pJW4303.The immuni zati on was performed by
4、 gene gun and in tramuscular injectio n in this experime nt.A nti-HBc(lgG)a nd its subtypes(lgG1,lgG2a)i n mice sera were detected by ELISA.HBcAg specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) activity was measured by51Chromium release assay.Results The expressi on of HBcAg was dem on strated by ELISA and We
5、stern-blot in 293T cells tran sfected with pJW4303/HBc.The en d-po int titers of serum an ti-HBc in immuni zed mice were 1 : 328 050 (gene gun method) and 1: 109 350 (intramuscularmethod ).ln both groups of gene gun and in tramuscular immunization,IgG2a level was sightly higher than that of IgG1.HBc
6、Ag specific CTL activities were 53.1% in gene gun group and 52.85%in in tramuscular group.C on clusi on The results showed that the DNA vacci ne of pJW4303/HBc had stro ng an tige necity in both cellular and humoralimmunity.DNA vaccine MiceKey words Hepatitis B core antigenDNA疫苗（基因疫苗）是近几年免疫学和分子生物学研究
7、的新兴领域，被称 之为疫苗的“第三次革命”。DNA疫苗的显著特点之一是目的基因进入机体后 的表达产物系内源性抗原，主要通过 MHC4类途径激发机体的免疫应答，其中 特异性CTL应答尤为突出。大量资料表明，慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎病 毒（HBV）慢性携带者体内针对HBV勺特异性CTL应答明显低下，纠正这种 CTL低 反应状态，对于机体有效地清除 HBV至关重要。鉴于HBV核心区基因产物 HBcAg是机体CTL的主要靶抗原，我们构建了 HBcAg DNA疫苗，并观察了该DNA 疫苗经基因枪和肌肉注射法接种后 H-2b小鼠的特异性细胞和体液免疫应答。材料与方法一、HBcAg DNAS苗的构建将经过
8、5端修饰的HBV核心区基因片段:3：（购自中国预防医学科学院病毒 研究所）插入质粒pUC18（Promega的 Pstl和BamH酶切位点，克隆成功后，再 将该重组质粒中含HBV核心区基因片段的Hind III和BamH酶切片段定向克隆 进质粒pJW4303系真核表达质粒，含CMVIP刻早期启动子，由美国马萨诸塞大 学医学中心 HL Robinson 教授惠赠）的相应克隆位点。该重组质粒即为 HBcAg DNA疫苗，命名为pJW4303/HBe二、pJW4303/HBc体外表达产物的鉴定分别取纯化的pJW4303/HBc和pJW4303无目的基因的对照质粒）约20卩g， 用磷酸钙法转染293T
9、细胞（一种用于瞬间转染的人胚肾细胞系），72小时后收 集并裂解细胞，低温下离心取上清。该细胞裂解产物经间接 ELISA法检出HBcAg经 Western-blot 证实在21Kd处有一清晰蛋白质条带，与 HBcAg分子量 相符；对照质粒的转染细胞裂解产物未检出HBcAg。三、pJW4303/HBc和 pJW4303的大量制备采用 QIAGEN Plasmid Purification（Giga）Kit（GIAGEN Inc.,Germany） 。 每2000mlHB101转化株菌液可获高纯度质粒约10mg四、小鼠来源、分组及血清标本采集68周龄雌性C57BL/6（H2）小鼠由美国马萨诸塞大学医
10、学中心动物实验中 心提供。共设4组，每组5只小鼠，耳洞法编号。组别为 pJW4303/HBc基因枪 组、pJW4303基因枪组、pJW4303/HBc肌内注射组及pJW4303肌内注射组。采用 毛细吸管眼静脉采血法采集小鼠血清，-70C冻存。五、免疫方法及免疫程序（一）基因枪法 基因枪为 Agrecetus Inc.（U.S.A） 产品，系高压氦气驱动类型。按2卩m质粒DNA 1mg金颗粒（1卩g,BIORAD）的比例分别制备含 pJW4303 和pJW4303/HBc的基因枪专用细管状子弹。每粒子弹含质粒DNA 1卩g。每只小鼠每次在腹部皮肤6处不同部位接受注射，基因枪所用压力为 400ps
11、i，接种剂 量为6卩g质粒DNA次小鼠。根据文献报道，未设单纯金颗粒对照组：4：。（二）肌内注射法 取相应质粒DNA 100卩g,以无菌生理盐水稀释至 100卩l。每只小鼠每次在其两后肢四头肌处各注射 50卩l，故接种剂量为 100卩g/次小鼠。（三）免疫程序 为0周、第4和第8周。每次免疫时接种方法及剂量相 同。每次免疫前及第10周时采集小鼠血清。六、抗HBcIgG及IgG亚类检测（一）抗-HBc-IgG检测以重组HBcAg南京军区医学研究所张林元研究员惠赠）0.1卩g/100卩I孔包被96孔ELISA板（Corning）。待测小鼠血清作系列3 倍稀释（1 : 50, 1 ： 150, 1
12、: 4501 : 885735 0）。以生物素化羊抗鼠IgG和亲 和素偶联HRP（Vector Laboratory Inc.）检测小鼠血清中抗 HBc终点滴度。抗HBc高滴度血清采用CORZYM试剂盒（Abbott）作抗HBc定量测定，并转换成 PEI（Paul Ehrlich In stitute） 单位。（二） 抗HBcIgG亚类检测 以小鼠IgG1, IgG2a标准品、HRP标记的羊抗 鼠 IgG1 或 lgG2a（Southern Biotechnology Associatesnc.）为主要试剂，分 别检测单个小鼠血清中抗 HBcIgG1和IgG2a水平，根据A（450nm）值计算
13、 IgG2a/IgG1 比值。七、特异性CTL功能测定PJW4303/HB（或pJW4303末次免疫4周（即第12周）时，在麻醉状态、无菌 条件下取小鼠脾脏，制备单个细胞悬液，分别用或不用H-2b小鼠限制性HBcAg特异性CTL表位多肽：句（序列为MGLKFRQL终浓度为10卩g/ml）作体外刺激， 37C培养6天。继以EL4细胞为靶细胞（用或不用上述多肽进行过夜孵育）作 51Cr释放试验（4小时孵育法），测定HBcAg特异性CTL杀伤活性，效应细胞：靶 细胞范围为12 ： 10.5 ： 1。特异性CTL杀伤率（%）=（实验孔Cr释放值-自然Cr释放值）/（最大Cr释 放值-自然Cr释放值）X
14、 100。一、各组小鼠血清抗HBc终点滴度见表1。接种pJW4303/HB（后小鼠产生了较高滴度的抗 HBo基因枪组的终 点滴度3倍于肌内注射组。经定量检测，终点滴度达1 : 109 350及以上的血清标本中，抗HBc含量均大于900PEI单位。pJW4303接种后小鼠仅有低滴度非特 异性抗体反应（ 1 : 450）。二、单个小鼠血清抗HBc终点滴度的比较见1。基因枪组各小鼠血清抗 HBc的滴度表1各组小组血清抗HBc的终点滴度组别采样时间0周4周8周10周PJW4303S因枪组50 150450450pJW4303/HBcS 因枪组50 4050109350328050PJW4303肌内注射
15、组50 150150450PJW4303/HB（肌内注射组50 4050364501093501个体小鼠血清抗HBc终点滴度高且均衡，4/5达1 : 328 050;而肌内注射组的抗体滴度则普遍降低 3倍，最低 者仅 1 : 4 050 o三、单个小鼠血清抗HBc亚类比值见表2。除基因枪组第5号小鼠外，两组其余小鼠的抗 HBclgG2a/lgG1比 值均大于1,提示以IgG2a为主。比较两组的平均IgC2a/IgG1比值，肌内注射 组显著高于基因枪组(P V 0.05)。表2 个体小鼠血清抗 HBcIgG亚类比值(IgG2a/IgG1)组别小鼠序号2345v.imagesessays311024054552398 (859 bytes) src=/med/ca no /201003/201003151 94608900 14 22sPJW4303/ HBc1221.22.91.51.550.8基因枪组I2021I90PJW4303/HBc14.10.12.45.12.19.1315.肌内注射 组423836955606*表中数值为ELISA(A450nm测定之IgG2a/IgG1比
